硝基四氮唑藍染色法、結晶紫染色法、固紫染色法、及Ziehl-Nidlsen染色法

硝基四氮唑藍染色法：

感染引起細胞內還原性輔酶I的活力增強，在細胞內酶的作用部位，導致無色的四氮唑藍（nitroblue tetrazoliun test,NBT)被還原為不溶于水的藍色沉淀物。這種大塊狀藍色沉淀物僅見于成熟和幼稚的嗜中性粒細胞胞漿中。文獻報道在細菌和真菌感染時，嗜中性粒細胞百分率升高（＞12%），康復期恢復正常。而病毒和結合感染時大多陰性。NBT測定還可以作為疾病病程和抗生素療效指標。

1、操作步驟如下

①將腦脊液與NBT工作液各0.5ml混合后，置于腦脊液細胞玻片離心沉淀器中。

②37℃水浴箱中孵育15min；

③取出腦脊液細胞沉淀器，離心后取下玻片，空氣干燥；

④MGG染色

2、主要試劑的制備

①磷酸緩沖液（0.15mol/L);Na2HPO41.52g， KH2PO4 0.496g，加入9g/L NaCl中之100ml，溶解后校正PH為7.2.

②NBT染液：臨用時將2g/L NBT生理鹽水溶液與上液等量混合即成。

結晶紫染色法：

結晶紫染色法操作簡單，主染核，變性細胞染色較淡。其原理是結晶紫染色可通過細胞的特定攝生法而選擇性地被細胞核吸收，死亡的細胞幾乎不吸收結晶紫燃料。

具體操作步驟：

①甲醇固定1min

②0.1%結晶紫水溶液3-5min

③96%乙醇分化2-3

固紫染色法：

固紫染色即（Gram染色。固紫陽性菌（鏈球菌等）染成深藍色，而奈瑟菌屬如腦膜炎雙球菌，假單胞菌如綠膿桿菌、腸道桿菌等則成陰性。

操作步驟

①干片于火焰上稍稍固定

②浸入結晶紫溶液中0.5-1min

③流水沖洗；

④浸入Luqol濃碘溶液中1min

⑤96%乙醇溶液中脫色

⑥流水沖洗

⑦浸入品紅溶液中1min

⑧流水沖洗待干。

溶液的制備

①Hucker結晶紫溶液。結晶紫200mg溶于蒸餾水*90ml內，再加0.1mol硼酸及硼酸鹽緩沖液10ml（PH9.0）。此液需新鮮配置，不得過頁。

②Luqol濃碘溶液。碘化鉀2g溶于蒸餾水10ml內，加碘1g，蒸餾水加至300ml。

③品紅溶液。蒸餾水100ml中韓品紅200mg。

Ziehl-Nielsen染色法：

抗酸染色（acid-fast stain）1982年由Ziehl-Nielsen*，因此又稱為萋-納氏（Ziehl-Nielsen）染色，主要針對抗酸桿菌。抗酸桿菌屬分枝桿菌，由于菌體壁上含有大量的脂類，一般染色不易著色，但能與堿性品紅染液結合成復合物，可抵抗算脫色作用，成紅色，背景藍色，對比清晰。

步驟如下：

①圖片干燥后，火焰或乙醇乙mi固定：

②滴加石碳酸付紅液于玻片上，火焰上徐徐加熱至有蒸汽出現，切不可沸騰，5min；

③崎嶇石碳酸液，流水沖洗；

④浸入3%的鹽酸酒精中搖蕩至無紅色脫落為止；

⑤流水沖洗；

⑥堿性美藍溶液負染30s

⑦流水沖洗，干后鏡檢。

溶液的制備：

①石碳酸品紅溶液：堿性品紅0.5g、無水乙醇10ml、石碳酸5g、蒸餾水90ml（堿性品紅乙醇飽和溶液10ml，5%石碳酸溶液90ml）

②鹽酸究竟：濃鹽酸3ml，95%乙醇97ml

③美蘭液；95%乙醇飽和美蘭液30ml加入10%氫氧化鉀0.1ml，蒸餾水100ml。

注意事項：

①抗酸染色用于細胞學圖片上時，可以適當增加標本的厚度以提高檢出率。

②細胞學圖片以火焰固定為好。

③品紅加熱不宜過猛過長。因為腦脊液中的結核桿菌比較赤裸，不像痰中結核桿菌包埋在粘液中，溫度過高可使細菌炸裂和難于辨認。

在做北京染色時（即蘇木精染色）盡量淺染，以免掩蓋紅色桿菌色調，影響檢出效果。

⑤該法常用石碳酸付紅染液覆蓋標本后加溫，冒蒸汽開始計時，隨時添加染液，保持濕潤，防止干燥，知道5min位置。染液用量多，操作復雜，并容易流到玻片外，沾污水或試驗臺。針對傳統的抗酸染色發的不足，許多學者對染色方法進行了改進，改良法將石碳酸付紅染色液先在沸水浴中加溫10min，在進行染色，結果尚可，可避免以上不足。