NGS在腫瘤檢測中的那些事兒

一、背景介紹

20世紀以來，癌癥已成為困擾人類健康的主要危害之一。根據2019年國家癌癥中心發布的2015年全國//////新癌癥統計數據，2015年惡性腫瘤發病約392.9萬人，死亡約233.8萬人。平均每天超1萬人被確診為癌癥，每分鐘7.5個人確診癌癥。癌癥負擔呈持續上升態勢，近10多年來，惡性腫瘤發病率每年保持約3.9％的增幅，死亡率每年保持2.5％的增幅。因而腫瘤基因突變檢測對指導腫瘤靶向治療、耐藥監測及預后判斷有重要意義。

圖1：中國2015年惡性腫瘤發病與死亡人數圖

二、腫瘤突變類型

腫瘤突變主要來源于體細胞突變和胚系突變。

胚系突變(germline mutation)又稱生殖細胞突變，是來源于精子或者卵子這些生殖細胞的突變，因此身上所有的細胞都帶有突變，目前主要是BRCA1/2，一般研究較少。

體細胞突變(somatic mutation)又稱獲得性突變，是指在生長發育過程中或者環境因素影響下后天獲得的突變，通常身上只有部分細胞帶有突變。

圖2：基因突變類型解析圖

體細胞突變包括序列變異、結構變異、腫瘤突變負荷（TMB）和微衛星不穩定性（MSI）。其中序列變異包括SNV(Single Nucleotide Variation)和Indel（Insertion & deletion）。結構變異包含Deletion、Duplication、Inversion和Translocation。

圖3：序列變異和結構變異解析圖

名詞解釋：

TMB就是基因中發生錯誤的密碼總量。TMB越高，那么可能相應的腫瘤相關的致癌突變越多，每個腫瘤的個性就越突出，越不同于正常細胞。腫瘤免疫治療的原理就是通過加強機體免疫系統對腫瘤的識別和殺傷。而腫瘤突變負荷越大（TMB越高），突變越多的癌細胞，越不像正常細胞，越容易被免疫細胞發現，自然無法逃脫免疫系統的追殺。一般認為TMB超過20個突變/Mb（Mb代表的就是每百萬個堿基）就是高，低于10個突變/Mb就是低。當然，不同的公司，由于所采用的基因套餐以及技術不同，略有差異。

MSI指的是微衛星不穩定性，指的是在DNA復制過程中段片段插入或者缺失突變引起的微衛星序列長度改變的現象，通常由錯配修復MMR功能缺陷引起。以二核苷酸重復序列（CA/GT）n///為常見，n一般是15-60次。MSI在維持基因組穩定以及調控基因表達中發揮重要作用，且個體差異較大。

三、常見的腫瘤突變檢測技術

傳統的腫瘤檢測方法包括Sanger測序、焦磷酸測序和實時熒光PCR等，僅能對單個基因或者單個基因的外顯子突變進行檢測，對復雜變異類型的檢測存在局限性。高通量測序（Nextgeneration sequencing,NGS）能夠同時對上百萬甚至數十億個DNA///片段進行測序，因此可以在較低的成本下對多至上百個腫瘤相關基因、全外顯子及全基因組進行檢測。

四、應用NGS進行腫瘤檢測的技術路線

NGS進行腫瘤基因突變檢測的技術路線主要包括：全基因組測序（WGS）、全外顯子測序（WES）和靶向捕獲測序（targeted sequencing）。

圖4：腫瘤檢測技術路線圖

全基因組測序：

全基因組測序可對整個基因組區域進行測序，包括編碼區、非編碼區等所有的基因區域進行測序。可實現對人類基因組范圍內所有的變異類型進行分析，包括SNV、 Indel,、CNV和 SV，甚至可以進行染色體水平變異的分析。弊端是測序需要很大的數據量，成本高，而且其中以大部分數據目前尚不能解釋，因此離實際臨床應用還存在較大距離。

全外顯子測序：

全外顯子測序可對基因組上所有的基因外顯子區域進行測序。全外顯子覆蓋人類基因組1-2%的蛋白質編碼序列。相比于WGS減少了對非編碼區的測序，成本更低，并且可以獲得更高的測序深度和檢測分辨率。但WES對于臨床檢測來說，腫瘤基因檢測測序深度較高，所需的數據量相對較高，因此從臨床應用以及成本考慮，WES并未被廣泛接受。

靶向捕獲測序：

靶向測序是指選擇基因組上感興趣的基因或基因區域作為靶向檢測區域，可以是幾個基因上的個別外顯子區域，也可以是幾百上千個基因上的全部外顯子區域。靶向測序兼顧了實際檢測需求，又降低了測序成本，因此目前在臨床上的應用///為廣泛。常見方法主要有：探針雜交捕獲以及多重PCR擴增。

五、小結

腫瘤問題屬于世界性難題，一直威脅著人類的健康，是人類生命健康的死敵。近幾年隨著精準醫療的快速發展，生命醫療與生物科學的準確對接，NGS已經逐步滲透到腫瘤病理分子診斷領域，大大豐富了腫瘤基因診斷的內容。NGS是目前常用的有效獲取人類癌癥基因組信息的高通量測序方法，能夠勾畫出腫瘤相關的遺傳變異全景，NGS技術為腫瘤精準醫療的進一步發展提供了基礎。

六、高效建庫，成就腫瘤突變精準

產品名稱：Hieff NGS® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina®  （點這里）

產品特點：
1）建庫流程更簡便：片段化/末修/加A一步完成，大大縮減建庫時間；

2）酶切可控時間長：酶切效果僅與時間有關，與物種來源以及樣本GC含量無關；

3）接頭連接更高效：接頭雙端連接效率高于60%，業內領///先；

4）文庫擴增更均一：高深度測序條件下，均一性與KAPA HiFi Ready-mix高度一致；

5）突變檢出更高效：突變檢出頻率與標準品預期突變更接近。

性能展示：結果表明翊圣建庫試劑盒突變檢出更高效。

【注】：實驗樣本：Horizon@HD701: Quantitative Multiplex Reference Standard gDNA

七、產品信息

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