產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

試劑盒內(nèi)含兩種熒光染料DMAO和EthD-III，可分別將活細菌和死細菌染上綠色和紅色。其中DMAO是一種綠色核酸熒光染料，可染色活細菌和死細菌。EthD-III是一種紅色核酸熒光染料，僅染色細胞膜受損的死細菌。將DMAO和EthD-III混合使用染色時具有完整細胞膜的細菌呈現(xiàn)綠色，而具有受損細胞膜的細菌呈現(xiàn)綠色和紅色。結(jié)果可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀來分析，適用于大多數(shù)細菌類型。

細菌活力的常見標準是細菌在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中繁殖的能力，稱為生長測定。該試劑盒通常與在液體或固體培養(yǎng)基中的生長測定結(jié)果有著很好的一致性。在某些條件下，膜損傷的細菌可能會在營養(yǎng)培養(yǎng)基中恢復并繁殖，而這種細菌在該測定中可能會被認為死亡。相反，一些具有完整膜的細菌可能無法在營養(yǎng)培養(yǎng)基中繁殖，但這些細菌在該測定中可能被認為是活的。因此，如果發(fā)現(xiàn)該檢測和細菌生長測定之間有相當大的差異，應該考慮上述的可能性。

光譜特性DMAO：Ex/Em=503/530nm（withNDA）； EthD-III：Ex/Em=530/620nm（withNDA）

產(chǎn)品組分

運輸與保存方法

冰袋（wet ice）運輸。儲存于 4ºC，至少可以儲存6個月。

注意事項

操作時請采取防護措施，穿防護服、戴一次性手套等。

使用方法

活、死細菌樣品對照制備

1. 在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 mL的細菌至晚期對數(shù)期。

2. 在EP管中準備兩份1mL的細菌液，并在5,000-10,000g條件下離心10-15 min。

3. 去除上清液，在其中一支EP管中加入0.3mL的0.85% NaCl重懸細菌，在另一管中加入1 mL的0.85% NaCl重懸細菌。

4. 在含有0.3 mL的0.85% NaCl的管中加入0.7 mL異丙醇，充分混合（終濃度為70% 的異丙醇）用以制備死細菌樣品。

5. 將兩種樣品在室溫下孵育1 h，每15 min混合一次。

6. 兩種樣品在5,000-10,000g條件下離心10-15 min。

7. 去除上清，在兩種樣品中加入1 mL的0.85% NaCl重懸細菌，并如步驟6再次離心。

8. 使用分光光度計測定兩種菌懸液在670 nm處的吸光值（OD670）。

9. 將兩種菌懸液（活的和死亡的）密度調(diào)整到108個細菌/ mL（OD670≈0.3），然后用0.85% 的NaCl以1：100稀釋，使終密度為106個細菌/ mL。

10. 如下所示混合兩種菌懸液以獲得所需的活細胞：死細胞比率。

表1. 活、死菌懸液按一定體積混合以達到所需的活細胞、死細胞比例

熒光顯微鏡的染色方法

1. 將1體積的DMAO和2體積的EthD-III在微量離心管中混合，充分混合后加入8體積的0.85% NaCl溶液以得到100×染料溶液。

2. 每100 μL菌懸液，加1 μL的100×染料溶液。

3. 充分混合，室溫下在黑暗中孵育15 min。

4. 取5 μL染色后的菌懸液滴在帶有18 mm方形蓋玻片的載玻片上。

5. 在熒光顯微鏡下觀察?；罴毦退兰毦臒晒饪梢栽谌魏螛藴实腇ITC長效過濾器下同時觀察到。或者，活的（綠色熒光）和死的（紅色熒光）細菌可以分別用FITC和Cy3（或TexasRed）通道觀察。

注意：
1) 在對細菌染色之前，必須注意除去生長介質(zhì)的殘留。核酸和其他培養(yǎng)基組分可以以某種方式結(jié)合DMAO和EthD-III染料，導致不可接受的染色變化。簡單的洗滌步驟通常足以從細菌懸浮液中除去干擾介質(zhì)組分。不建議使用磷酸鹽緩沖液，因為它們會降低染色效率。
2) 在開始正式實驗前應調(diào)節(jié)染料濃度來使DMAO標記活細菌、使EthD-III標記死細菌進行區(qū)分。*濃度可能因細菌菌株的不同而異。一般使用能夠提供充足信號的低染料濃度。以下條件針對大腸桿菌活/死細胞染色進行了優(yōu)化。

細胞流式的染色方法

實驗開始前，請閱讀熒光顯微鏡染色步驟下的注意事項。

1. 根據(jù)表1，在EP管中加入11種不同比例的活細菌和死細菌。11種樣品中每種的體積1 mL。

2. 將12 μL的DMAO儲備溶液與24 μL的EthD-III儲備液在微量離心管中混合。11個樣品中的每個加入3 μL的混合染料，通過上下吹打幾次*混合。（注意：需要準備另外的對照細菌樣品用于單獨的DMAO和單獨的EthD-III染色）

3. 室溫下在黑暗中孵育15 min。

4. 使用流式細胞儀分析每個樣品，使用DMAO陽性細胞的FITC通道和EthD-III陽性細胞的PI或PE通道。