高致病性豬藍耳病病毒核酸熒光PCR檢測試劑盒
前言
本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術，是針對豬藍耳病毒設計的檢測體系，用于豬血清和組織等樣本的檢測。
試劑盒組成成分
組成成份（48Tests/kit） | 規格 |
核酸擴增試劑 |
|
RT-PCR反應液 | 994.5µl×1管 |
Taq酶(5U/µl) | 15.5µl×1管 |
Enhancer | 10.5µl×1管 |
對照品 |
|
陰性對照 | 25µl×1管 |
陽性對照 | 25µl×1管 |
儲存條件及有效期
本試劑盒貯存于-20℃的條件下有效期為6個月。
適用儀器(熒光PCR檢測儀)
Ø ABI公司Prism7000、7300、7500系列
Ø RotorGene系列
Ø Bio-Rad公司的iCycler系列
【自備試劑】
核酸提取試劑。
【樣本采集、存放及運輸】
1．樣本采集：各類型樣本按照常規方法采集。
2．存放：分離后的血清或血漿樣本在2℃—8℃條件下保存應不超過72h，-70℃以下可長期保存，但應避免反復凍融（多凍融3次）。
3．運輸：采用冰hu或泡沫箱加冰密封進行運輸。
【檢驗方法】
1．樣本處理（樣本處理區）：
用戶可采用病毒RNA提取試劑盒提取RNA用于檢測或保存與-20℃（-80℃更佳）以待檢測。說明：陽性對照及陰性對照無需提取，直接上樣。
2．擴增試劑準備（PCR前準備區）：
從試劑盒中取出RT-PCR 反應液、Taq酶及PCR Enhancer，室溫融化并振蕩混勻后，2000rpm離心10秒。設所需要的PCR反應管管數為n（n = 樣本數 + 1管陰性對照 + 1管陽性對照），每個測試反應體系配制如下表：
試劑 | RT-PCR反應液 | Taq酶 | PCR enchancer |
用量 | 19.5 µl | 0.3ul | 0.2 µl |
計算好各試劑的使用量，加入一適當體積離心管中，充分混合均勻，2000rpm離心10秒，向設定的n個PCR反應管中分別加入20 µl，轉移至樣本處理區。
3．加樣（樣本處理區）：
向所設定的n個PCR 反應管中分別加入待檢樣本RNA、陰性對照和陽性對照各5µl，蓋緊管蓋，轉移至檢測區。將PCR反應管排好放入PCR儀內，記錄樣本擺放順序。
4．PCR擴增（檢測區）
4.1 循環條件設置
50℃：30 min；
95℃：3 min；
95℃：10 sec, 60℃: 1min 40個循環。
熒光信號收集設在60℃。反應體系設為25ul。
4.2 儀器檢測通道選擇
待測熒光為FAM熒光素，熒光PCR檢測儀熒光信號收集設定為FAM熒光素。
5．結果分析條件設定：
5.1 閾值(threshold)設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照曲線（無規則的噪音線）的高點為準。
5.2 基線（baseline）應選擇該次實驗指數擴增前所有樣本熒光信號比較穩定的一段區域（所有樣本熒光信號無較大波動），起始點（循環數）應避開熒光采集起始階段的信號波動，終止點（循環數）應比早出現指數擴增的樣本Ct值減少1-2個循環。
注：具體設置方法請參照各儀器使用說明書。
6．質控標準：
陰性對照的檢測結果應為陰性；
陽性對照的Ct值應小于等于32.0。
1．結果判斷：
Ø Ct值無讀數的樣本為陰性。
Ø Ct值≤38.0的樣本為陽性。
Ø Ct值大于38.0的樣本建議重做。
重做結果Ct值＜40.0為陽性，否則為陰性。
【試劑盒使用注意事項】
1. 有關實驗室管理規范請嚴格按照行業行政主管部門頒布的有關基因擴增檢驗實驗室的管理規范執行。
2. 本試劑盒僅用于體外檢測。
3. 實驗請嚴格分區操作：
*區：PCR前準備區——準備擴增所需試劑；
第二區：樣本處理區——待測樣本和對照品處理；
第三區：檢測區——PCR擴增檢測。
4. 各區物品均為，不得交叉使用，避免污染，實驗后即請清潔工作臺。
5. 試劑盒內各試劑使用前，充分融化后請稍事離心。
6. 在－20℃保存的樣本裂解產物，應在加樣前置室溫解凍，作短暫離心后使用。
7. 分裝有反應液的反應管應扣蓋或裝入密實袋內再轉移至樣本區。
8. 加樣時應使樣品*落入反應液中，不應有樣品粘附于管壁上，加樣后應盡快蓋緊管蓋。
9. 擴增完畢立即取出反應管，密封在塑料袋內，丟棄于地點。
10. 反應液分裝時應盡量避免產生氣泡，上機前注意檢查各反應管是否蓋緊，以免熒光物質泄露污染儀器。
11. 實驗中用過的吸頭請直接打入盛有1%次氯酸鈉的廢物缸內，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。
12. 工作臺及各物品定期用1%次氯酸鈉、75%酒精或紫外燈進行消毒。
1．結果判斷：
Ø Ct值無讀數的樣本為陰性。
Ø Ct值≤38.0的樣本為陽性。
Ø Ct值大于38.0的樣本建議重做。
重做結果Ct值＜40.0為陽性，否則為陰性。
【試劑盒使用注意事項】
1. 有關實驗室管理規范請嚴格按照行業行政主管部門頒布的有關基因擴增檢驗實驗室的管理規范執行。
2. 本試劑盒僅用于體外檢測。
3. 實驗請嚴格分區操作：
*區：PCR前準備區——準備擴增所需試劑；
第二區：樣本處理區——待測樣本和對照品處理；
第三區：檢測區——PCR擴增檢測。
4. 各區物品均為，不得交叉使用，避免污染，實驗后即請清潔工作臺。
5. 試劑盒內各試劑使用前，充分融化后請稍事離心。
6. 在－20℃保存的樣本裂解產物，應在加樣前置室溫解凍，作短暫離心后使用。
7. 分裝有反應液的反應管應扣蓋或裝入密實袋內再轉移至樣本區。
8. 加樣時應使樣品*落入反應液中，不應有樣品粘附于管壁上，加樣后應盡快蓋緊管蓋。
9. 擴增完畢立即取出反應管，密封在塑料袋內，丟棄于地點。
10. 反應液分裝時應盡量避免產生氣泡，上機前注意檢查各反應管是否蓋緊，以免熒光物質泄露污染儀器。
11. 實驗中用過的吸頭請直接打入盛有1%次氯酸鈉的廢物缸內，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。
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