Hieff® Fast Cell Direct Probe RT-qPCR Kit 適用于對各種動物細胞進行基因定量表達分析（如cell line 化的貼壁細胞和懸浮細胞、原代培養細胞、各種干細胞、iPS 細胞等），無需提RNA，可直接進行qPCR表達分析，用時短，操作簡單，出錯率低，最短只需1.5 h就可高效完成從模板制備到反轉錄反應及基因表達分析等步驟。該產品為探針法細胞直擴RT-qPCR試劑盒的熒光定量qPCR模塊，為補充試劑。

儲存條件

長期保存時請于-25~-15℃保存，有效期1年。

使用說明

一、裂解產物的制備

1. 將試劑放置室溫下融化，使用前上下顛倒，輕輕混勻，并輕微離心后使用，避免起泡。沒有混勻試劑、使用振蕩器混勻、未在冰上配置試劑等會導致反應性能下降。

2. 將細胞轉移至離心管中*，5000 rpm離心2 min收集細胞**，充分吸除培養基。若貼壁細胞在96孔板中培養，可直接吸除培養基。

3. 各個孔內加入FCD Washing Buffer 150 μL，吸打清洗細胞，5000 rpm離心2 min，吸盡FCD Washing Buffer。

4. 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液，2 μL DNase I溶液，室溫吸打混勻后靜置5 min，孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混勻5次左右，即可得到裂解產物****，細胞數量超過1× 105 cells時可能會有裂解殘留物屬正常現象。

*50 μL裂解體系適配細胞數的基本要求是每孔1× 102 - 1× 105 cells，若細胞數量較多，可適當等比例增加FCD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。

**不同細胞的離心條件不同，請使用適合于所用細胞的離心速度進行離心。

***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依實驗需要，加入裂解液量增大時需相應增大FCD Stop Solution的量。

****細胞裂解產物溶液長期保存時，請置于-25~-15℃。

二、反轉錄

1. 室溫融化4× Hifair® FCD RT Mix后輕微顛倒混勻，置于冰上并按下表配置反應體系：

表1 反轉錄反應體系

*避免吸入細胞碎片，推薦使用量為2 μl，最大不超過反應體系的55%。

2. 移液器輕輕混勻上述配制的反應液，按下表程序進行反轉錄反應**：

表2 反轉錄反應程序

**反轉錄溫度推薦使用37℃，反轉錄產物可直接進行下游qRT-PCR檢測。為避免反轉錄體系對qPCR反應的抑制，得到合適的Ct值（10-35），可將產物稀釋10-1000倍后使用。若短時間內不進行下游實驗，可放置于-25~-15℃保存。

三、熒光定量PCR

1. 體系配置

使用下列組份比例配制反應液（配制過程請于冰上進行）：

表3 qPCR反應體系

*高濃度模板易導致非特異擴增，可適當將模板稀釋5-50倍。模板推薦用量4 μL。反應性能較差時，可以在0.2-1.0 μM范圍內調整引物探針濃度。

2. 熒光定量PCR快速擴增程序（推薦）

本產品推薦使用快速程序擴增，可大大減少反應時間。使用Tm值較低的引物難以擴增時，可額外調整退火溫度。

表4 qPCR反應程序（快速）

**退火/延伸溫度、終延伸時間可根據實驗要求適當調整。 快速程序適用于絕大多數基因，個別復雜二級結構基因可嘗試常規程序。

3. 熒光定量PCR常規擴增程序

實驗儀器不滿足快速反應時間時，也可使用常規程序進行擴增。

表5 qPCR反應程序（常規）

注意事項

1. 使用前，將凍存的各組分充分融解并輕輕混勻后使用。

2. 實驗時，請盡量使用無污染的耗材，避免污染。

3. 本產品避免反復凍融，配制時應避免強光照射。

4. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

5. 本產品僅作科研用途！

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