Mechanical stress protects against chondrocyte pyroptosis through TGF-β1-mediated activation of Smad2/3 and inhibition of the NF-κB signaling pathway in an osteoarthritis model

Keywords: Chondrocyte; Exercise therapy; Mechanical stimulation; Osteoarthritis; Pyroptosis; TGF-β1.

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種常見的慢性關(guān)節(jié)疾病。研究學(xué)者推薦 OA 患者進(jìn)行運(yùn)動作為非藥物治療手段。運(yùn)動提供的機(jī)械力是軟骨穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素，包括軟骨細(xì)胞表型、炎癥反應(yīng)和合成代謝-分解代謝平衡。盡管運(yùn)動療法得到了解剖學(xué)特征的支持，但關(guān)于運(yùn)動計劃的推薦持續(xù)時間和強(qiáng)度，以及它們對 OA 提供保護(hù)的潛在機(jī)制一直存在爭議。

細(xì)胞焦亡是一種促炎性的程序性細(xì)胞死亡過程，被認(rèn)為與 OA 軟骨中存在空腔隙和細(xì)胞減少有關(guān)。一些研究已闡明了靶向焦亡以抑制或逆轉(zhuǎn) OA 的治療意義。因此，有理由推測類似的細(xì)胞焦亡抑制可應(yīng)用于 OA 的運(yùn)動療法。

TGF-β1 是 TGF-β 超家族的一種亞型。低水平的 TGF-β1 可能導(dǎo)致軟骨退變，TGF-β1 通路的激活對于在 OA 進(jìn)展期間維持軟骨完整性至關(guān)重要。相反，過度的 TGF-β1 信號會加劇軟骨和骨骼中的 OA 樣表型。最近的一項研究證實，血漿中的 TGF-β1 在運(yùn)動后達(dá)到峰值，并在 1 小時內(nèi)恢復(fù)到基線水平。這可能表明機(jī)械應(yīng)力促進(jìn)了 TGF-β1 的內(nèi)源性產(chǎn)生。因此，調(diào)整運(yùn)動強(qiáng)度，使軟骨細(xì)胞中的 TGF-β1處于適當(dāng)濃度，對于治療 OA 是值得的。

據(jù)此，中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院超聲科、急診科及骨外科的研究團(tuán)隊推測 TGF-β1 在 OA 治療中充當(dāng)運(yùn)動和細(xì)胞焦亡之間的中繼站，并進(jìn)行了深入研究，旨在探討細(xì)胞焦亡在 OA 運(yùn)動療法中的作用，以及 TGF-β1 誘導(dǎo)的其調(diào)節(jié)機(jī)制。研究成果發(fā)表在 Biomedicine & Pharmacotherapy 期刊題為“Mechanical stress protects against chondrocyte pyroptosis through TGF-β1-mediated activation of Smad2/3 and inhibition of the NF-κB signaling pathway in an osteoarthritis model”。該研究為 TGF-β1 在 OA 發(fā)病機(jī)制中的作用提供了見解，并為 OA 患者提供了合適的運(yùn)動計劃。

首先，基于GEO公共數(shù)據(jù)庫對正常軟骨樣本和 OA 軟骨樣本GSE57218數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析。與正常樣本相比，OA 軟骨中分別有大約 359 個和 357 個基因上調(diào)和下調(diào)。一些差異表達(dá)基因（DEGs），包括 TGF-β 家族成員，具有強(qiáng)烈的顯著差異。與對照組相比，OA 組的 TGF-β1 表達(dá)略有降低，這促使研究人員繼續(xù)探索機(jī)械應(yīng)力是否可以內(nèi)源性地恢復(fù) OA 軟骨中 TGF-β1 表達(dá)的降低。

因此，實驗繼續(xù)驗證 TGF-β1 與 OA 之間的關(guān)聯(lián)。通過 X 射線成像觀察到骨贅增生或關(guān)節(jié)間隙狹窄等 OA 特征（圖1 A）。軟骨樣本分為未受損（U）和受損（D）區(qū)域，H&E染色和甲苯胺藍(lán)染色顯示受損區(qū)域的 OARSI 評分顯著升高（圖1 B）。此外，TGF-β1 表達(dá)的變化與膠原蛋白II 的變化一致，在受損區(qū)域顯著低于未受損區(qū)域（圖1 C）。

圖1    與 OA 患者關(guān)節(jié)軟骨未受損區(qū)域的 TGF-β1 表達(dá)相比，受損區(qū)域的表達(dá)下調(diào)。（A）OA 患者的 X 射線照片。（B）OARSI 評分的 OA 患者受損和未受損區(qū)域的 H&E 和甲苯胺藍(lán)染色。（C）1-3 號患者軟骨中膠原蛋白II 和 TGF-β1 的蛋白質(zhì)印跡分析。柱狀圖顯示了所有 8 名患者的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

接下來，對OA患者的軟骨細(xì)胞進(jìn)行不同濃度 TGF-β1（0、0.5、1、2、16 ng/mL）和不同強(qiáng)度循環(huán)拉伸應(yīng)力（CTS，4%、6%、8%、10%，0.5 Hz，12 h）干預(yù)。結(jié)果表明，TGF-β1 顯著增加細(xì)胞內(nèi)膠原蛋白II 的水平，尤其是在 4 ng/mL 濃度時。然而，與 4 ng/mL 相比，高濃度的 TGF-β1 逆轉(zhuǎn)了這種作用。此外，8% 強(qiáng)度的 CTS 會增加膠原蛋白II 的水平，且TGF-β1 水平也隨著 CTS 強(qiáng)度的增加而升高。值得注意的是，在 6%、8% 和10% 強(qiáng)度下，TGF-β1 水平與對照組有統(tǒng)計學(xué)差異。用 10 μM RepSox（TGFβ R-1抑制劑）抑制 TGF-β1 后，無論是否進(jìn)行 CTS 處理，膠原蛋白II 的水平都會顯著降低。這表明。CTS 通過增加 TGF-β1 來拯救OA 過程中的軟骨細(xì)胞。

CTS 顯著降低細(xì)胞焦亡相關(guān)標(biāo)志物 NLRP3、pro-caspase、caspase 1、IL-1β 和 GSDMD-N水平，而 TGF-RI、Smad2、Smad3 和 IκB 顯著升高（圖2 A）。這些趨勢在用 RepSox 處理后發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，然而，IκB 的結(jié)果卻相反。

TGF-β1是NF-κB通路的上游調(diào)控因子，因此，實驗探索了 NF-κB 通路（圖2 B）。用 10 μM SIS3 阻斷 Smad 通路后，觀察到 TGF-β1 降低了細(xì)胞核中的 NF-κB p65。免疫熒光染色描繪了 NF-κB 和 Smad 2 的亞細(xì)胞定位（圖2 C、D）。在用 CTS 處理軟骨細(xì)胞期間觀察到 NF-κB 的核易位，同時Smad2 的核易位被激活。CTS 減弱了 ROS 在軟骨細(xì)胞中的積累以緩解氧化應(yīng)激，這可以通過 RepSox 阻斷 TGF-β1 來逆轉(zhuǎn)（圖2 E）。TEM 圖像表明 CTS（8%，0.5 Hz，12 h） 可以改善 OA 患者軟骨細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)，如細(xì)胞腫脹、細(xì)胞膜突出和細(xì)胞核皺縮（圖2 F）。NLRP3 抑制劑 MCC950 和 CTS 在增加軟骨細(xì)胞膠原蛋白II 方面顯示出相似的作用，這表明MCC950 可以減輕 OA。此外，SYTOX 染色顯示 CTS 通過 TGF-β1 減少軟骨細(xì)胞死亡，這可能暗示細(xì)胞焦亡受到抑制（圖2 G）。總之，這些數(shù)據(jù)表明，CTS 通過 TGF-β1 協(xié)調(diào)激活 Smad2/3 并抑制 NF-κB 信號保護(hù) OA 軟骨細(xì)胞免于焦亡。

圖2     在 CTS 處理中，升高的 TGF-β1 激活 Smad2/3 并抑制 NF-κB 核易位以抑制軟骨細(xì)胞焦亡。（A）CTS 和 10 μM RepSox 處理抑制 TGF-β1 下 NLRP3、TGF-β R I、Smad2、Smad3、pro-caspase-1、caspase-1、IκB-α、IL-1β 和 GSDMD-N 的蛋白質(zhì)印跡分析。（B）4 ng/mL TGF-β1 和 10 μM SIS3 處理以抑制 Smad 通路下細(xì)胞質(zhì)中 IκB-α、IL-1β 和 NLRP3 以及細(xì)胞核中 NF-κB p65 的蛋白質(zhì)印跡分析。（C、D）NF-κB p65 和 Smad 2 的核易位。（E）軟骨細(xì)胞中的 ROS 熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)。（F）軟骨細(xì)胞的TEM。（G）軟骨細(xì)胞的 SYTOX 綠染色。

最后，研究人員通過關(guān)節(jié)注射碘乙酸鈉（MIA）建立了大鼠膝關(guān)節(jié) OA 模型，并進(jìn)行了不同強(qiáng)度的跑步機(jī)鍛煉（圖3 A）。OAG 大鼠的 Mankin 和 OARSI 評分顯著升高（圖3 B、C）。跑步機(jī)運(yùn)動在中等強(qiáng)度下達(dá)到最佳治療效果，然而，根據(jù)改良的 Mankin 評分和 OARSI 評分，高強(qiáng)度運(yùn)動加劇了OA 進(jìn)展（圖3 B、C）。此外，RepSox 對 TGF-β 1 的抑制逆轉(zhuǎn)了中等跑步機(jī)運(yùn)動的治療效果（圖3 B、C）。圖3 D的軟骨變化與圖3 F的H&E染色和甲苯胺藍(lán)染色一致。OAM組比OAL和OAH組軟骨表面更光滑，軟骨陷窩更豐富，療效最好。X 射線成像和計算機(jī)斷層掃描也表明適度的跑步機(jī)運(yùn)動緩解了關(guān)節(jié)間隙狹窄、骨贅增生和軟骨下囊腫（圖3 E、G）。

此外，關(guān)節(jié)內(nèi)灌洗液（IALF）中 TNF-α 和 IL-1β 水平的變化與血清中相似，且在 OAM 大鼠中觀察到較低濃度。OAM 大鼠中觀察到最佳治療效果，膠原蛋白II 和 TGF-β 1 顯著增加，NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 和 IL-1β 顯著降低。這表明，中等強(qiáng)度跑步機(jī)運(yùn)動通過 TGF-β1 抑制細(xì)胞焦亡，發(fā)揮軟骨保護(hù)作用。

圖3    中等強(qiáng)度跑步機(jī)運(yùn)動在大鼠膝關(guān)節(jié) OA 模型中通過 TGF-β1 發(fā)揮最佳抗 OA 作用。（A） 動物實驗設(shè)計（10 只大鼠/組）。實驗組：CG = 對照組；OAG = 注射 MIA 的 OA 組；OAL = OAG 進(jìn)行低強(qiáng)度跑步機(jī)鍛煉（15.2 m/min with 0° of inclination，60 min/day，5 days/week for 4 weeks）；OAM = OAG 進(jìn)行中等強(qiáng)度的跑步機(jī)鍛煉（19.3 m/min with 5° of inclination，60 min/day，5 days/week for 4 weeks）；OAH = OAG 進(jìn)行高強(qiáng)度跑步機(jī)鍛煉（19.3 m/min with 5° of inclination，60 min/day，5 days/week for 4 weeks）；OAM + RepSox = OAM 與 RepSox 干預(yù)。（B）改良的 Mankin 分?jǐn)?shù)，+aP = 0.024。（C）OARSI 分?jǐn)?shù)。（D）大鼠膝關(guān)節(jié)的大體成像。（E）大鼠膝關(guān)節(jié)的 X 射線成像。（F）大鼠膝關(guān)節(jié)的 H&E 和甲苯胺藍(lán)染色。（G）大鼠膝關(guān)節(jié)的計算機(jī)斷層掃描成像。

圖4     圖形概要

機(jī)械應(yīng)力通過增加 TGF-β 1 抑制軟骨細(xì)胞焦亡的相關(guān)分子機(jī)制。機(jī)械應(yīng)力通過 TGF-β1 對 Smad2/3 的協(xié)調(diào)激活和對 NF-κB 信號通路的抑制來防止焦亡。運(yùn)動誘導(dǎo)的 TGF-β1 升高與細(xì)胞膜上的 TGF-β1 I 型受體（TGF-β1 R1）結(jié)合。一方面，這個過程促進(jìn)了 Smad2/3 的募集，導(dǎo)致 Smad2/3/4 復(fù)合物的形成。磷酸化的 Smad2/3/4 可以易位到細(xì)胞核。然而，TGF-β1 R1 的激活抑制了NF-κB-p65-IκBα 復(fù)合物中 NF-κB p65 的釋放，從而誘導(dǎo) NF-κB p65 的核易位。在細(xì)胞核中，Smad2/3/4 磷酸化的增加和 NF-κB p65 表達(dá)的降低通過調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)來抑制焦亡。

總之，該研究表明， OA 中中等強(qiáng)度的機(jī)械負(fù)荷保護(hù)軟骨細(xì)胞免受焦亡。機(jī)械刺激強(qiáng)度不當(dāng)可能會加重體外和體內(nèi)的 OA。此外，TGF-β 1 的升高是機(jī)械刺激依賴性的，并對軟骨細(xì)胞焦亡產(chǎn)生抑制作用。過量的內(nèi)源性 TGF-β1 可能是不適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動誘導(dǎo)的 OA 進(jìn)展的潛在原因。運(yùn)動誘導(dǎo)的 TGF-β1 協(xié)調(diào)激活 Smad2/3 并抑制 NF-κB 信號通路以抑制 OA 中的焦亡。因此，這項研究為開發(fā)安全有效的 OA 運(yùn)動療法提供了理論框架。

參考文獻(xiàn)：Wang Y, Jin Z, Jia S, Shen P, Yang Y, Huang Y. Mechanical stress protects against chondrocyte pyroptosis through TGF-β1-mediated activation of Smad2/3 and inhibition of the NF-κB signaling pathway in an osteoarthritis model. Biomed Pharmacother. 2023 Mar;159:114216. doi: 10.1016/j.biopha.2023.114216. Epub 2023 Jan 11. PMID: 36634591.

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