Mechanosensitive protein polycystin-1 promotes periosteal stem/progenitor cells osteochondral differentiation in fracture healing

Keywords: Fracture healing; Mechanical stress; Periosteal Stem/Progenitor Cells; Polycystin-1.

骨膜干/祖細胞（PSPCs）具有多向分化潛能和自我更新能力，在骨折愈合中起關鍵作用。值得注意的是，適度的生物力學環(huán)境有利于PSPC功能和骨折愈合，適度的機械力促進 PSPC 介導的愈傷組織形成，而機械卸載導致 PSPC 功能障礙、異常骨痂形成，并最終延遲愈合或不愈合。目前已經確定了骨折愈合過程中標記 PSPC 的幾種標志物，包括組織蛋白酶K（Ctsk）、PDGFRα 和 Prrx1。

多囊蛋白1（PC1）是一種由 Pkd1 基因編碼的大跨膜蛋白，其胞外結構域充當機械刺激的傳感器，而胞內結構域可與 PC2 和 TAZ 形成復合物，將信號傳遞到細胞，因此表現(xiàn)出與眾不同的功能。在成骨細胞譜系的早期階段，Pkd1 的選擇性失活表現(xiàn)出成骨受損和嚴重的骨質疏松表型，然而，PC1 在皮質骨穩(wěn)態(tài)或骨再生中的作用尚未確定。

基于此，中南大學湘雅醫(yī)院李長俊/羅湘杭教授團隊在 Theranostics 雜志發(fā)表了題為“Mechanosensitive protein polycystin-1 promotes periosteal stem/progenitor cells osteochondral differentiation in fracture healing”的研究成果。在這項研究中，他們證明了CTSK+ PSPCs 可以感知機械應力并通過 PC1 調節(jié)骨軟骨生成和骨修復。機制研究表明，PC1 通過 PC1-CTT 裂解促進轉錄共激活因子 TAZ 的核易位，并在調節(jié) PSPCs 的骨軟骨分化中發(fā)揮重要作用，且應用專門靶向 PC1-TAZ 軸的小分子 Zinc01442821 改善了機械卸載引起的延遲愈合。這些發(fā)現(xiàn)表明，靶向該軸可能是一種增強機械卸載中骨折愈合的很有希望的治療策略。

首先，通過分析骨折后不同時間點后肢去負荷（HU）小鼠模型的愈合過程，探討骨折愈合的力學調控，發(fā)現(xiàn) HU 組小鼠在骨折20 天后出現(xiàn)骨折不愈合，愈傷組織指數（CI）降低，軟骨形成顯著受損，軟骨島變小和骨折部位編織骨面積減少，這表明機械卸載誘導骨折修復延遲。

對骨折部位愈傷組織的單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）分析表明，其中的 PSPCs 反應早且迅速，是骨折愈合過程中形成軟骨愈傷組織的主要來源。隨后比較了先前鑒定的標記 PSPCs 的標志物，包括Ctsk、Prrx1、Pdgfrα、Pdgfrβ、LepR、Mx1、Nes 和 Gli1，發(fā)現(xiàn) Ctsk-陽性 PSPCs 的比例最高，并且在骨折后急劇增加，這意味著CTSK+ PSPC 可能是參與骨折愈合的主要源頭。

為了更好地理解CTSK+ PSPCs 在骨折愈合中的作用，比較了 Ctsk-陽性或 Ctsk-陰性 PSPCs 中的差異表達基因（DEGs）。GO 分析顯示，這些 DEGs 與機械刺激反應相關，表明 Ctsk-陽性 PSPCs 可能代表骨折后對機械刺激反應的主要細胞亞群。因此，接下來選擇使用CTSK+ 細胞研究骨折修復過程中機械刺激對 PSPC 功能的影響。使用骨鈣素（OCN）抗體的原位熒光染色顯示，HU小鼠愈傷組織中OCN-陽性 GFP+ PSPCs顯著減少，Ctsk+ PSPCs 顯示 II 型膠原蛋白（ColII）熒光強度降低。這些數據表明，Ctsk+ PSPCs 對機械敏感，其成骨和軟骨形成能力因骨折愈合過程中的機械卸載而受損。

進一步分析HU組和對照組骨愈傷組織中機械感應相關基因，發(fā)現(xiàn)除了 Pkd2、Fak 和 Conexin43 之外，Pkd1（PC1 的編碼基因）的表達在機械卸載時顯著下調（圖1 A）。同時，HU組骨愈傷組織在第 7 和 10 天 PC1 水平顯著降低（圖1 B、C）。對Ctsk-Cre；YFP+/+ 小鼠骨折愈傷組織進行 PC1 免疫熒光染色，觀察到HU處理組愈傷組織區(qū)域中 Ctsk-陽性細胞的 PC1 水平顯著降低（圖1 D、E）。

為了驗證機械應力對體外 PSPC 功能和 PC1 水平的直接影響，對分離的原代 PSPCs 進行流體剪切應力（FSS）刺激，發(fā)現(xiàn) FSS 處理的 PSPCs 中的 Pkd1 水平增加（圖1 G）。PSPCs 的骨軟骨形成能力也隨著 Cola2-1、Acan（軟骨形成標志物）（圖1 F、H）和 Runx2、ALP 和 Sp7（成骨標志物）（圖1 I、J）表達水平的增加而增強。這些數據顯示了 PSPCs 中響應不同機械刺激的 PC1 水平變化。

圖1     機械刺激影響Ctsk+ PSPCs中 PC1水平。

接下來，構建 Pkd1-Ctsk-CKO 小鼠（Pkd1^flox/flox 小鼠為對照）研究 Pkd1 在CTSK+ PSPCs 功能和皮質骨形成中的作用。CTSK+ PSPCs 中Pkd1 的缺失導致股骨皮層明顯變薄（圖2 A、B），皮質骨表面 OCN-陽性成骨細胞數量減少（圖2 C、D）。H&E 染色還證實 Pkd1-Ctsk-CKO 小鼠的皮質骨體積低于對照組（圖2 E）。這些結果表明，CTSK+ 祖細胞/干細胞中Pkd1 對于皮質骨形成和穩(wěn)態(tài)是關鍵的，且 Pkd1 的特異性缺失可導致皮質厚度減少。

通過將 Pkd1 siRNA 轉染到 PSPCs 進一步驗證了 Pkd1 對 PSPCs的直接影響（圖3 F），隨后又評估了骨軟骨形成特征，發(fā)現(xiàn)用 Pkd1 siRNA 轉染的 PSPCs 顯示成骨基因（Runx2、Alp 和 Bglap）（圖2 G-J）和軟骨生成基因（Coll0a-1、Col2a1 和 Acan）（圖2 K-N）表達降低。這些結果表明，PC1 對于 PSPCs 的骨軟骨分化和皮質骨形成是很重要的。

此外，CTSK+ PSPCs 中Pkd1 的缺失減少了愈傷組織的大小和骨化。同時，組織學分析表明，Pkd1-Ctsk-CKO 軟骨愈傷組織體積減小、骨形成受損，骨小梁減少，OCN+ 成骨細胞數量較低。這表明，PSPCs 中 Pkd1 的缺失對骨愈合有不利影響。

為了評估 PC1 是否介導機械卸載對骨折愈合和 PSPC 功能的影響，對Pkd1-Ctsk-CKO 和 WT 小鼠的HU模型進行了骨折處理。與機械卸載下WT 小鼠中觀察到的延遲骨折愈合相比，Pkd1-Ctsk-CKO 小鼠未觀察到愈傷指數的顯著差異及愈傷組織體積和 OCN+ 成骨細胞數量的進一步減少。這些發(fā)現(xiàn)表明，Pkd1 缺失后，CTSK+ PSPCs 的機械傳感能力顯著降低，最終導致 Pkd1-Ctsk-CKO 小鼠對卸載相關骨折表型產生耐藥性，這為 Pkd1 在骨折愈合過程中 PSPCs 機械轉導中的作用提供了有力的證據。

圖2    Ctsk+ PSPCs中Pkd1缺失會損害骨形成。

PC1 的 C 端尾部（CTT）將細胞外機械刺激線索轉導到細胞內部，促進轉錄調控。因此，實驗在 PSPCs 中過表達 PC1-CTT 并測試了骨軟骨分化能力，確認了PC1-CTT 過表達促進了 PSPCs 的骨軟骨分化。隨后使用限制 PC1-CTT 裂解和釋放的γ分泌酶抑制劑（ DAPT）發(fā)現(xiàn)PSPCs 顯示骨軟骨生成相關基因表達的降低和軟骨細胞分化受損。體外數據顯示，在不存在 Pkd1 的情況下，PC1-CTT 的過表達增強了 PSPCs 的骨軟骨分化，且DAPT 抑制了成骨。

以往研究表明，PC1與轉錄輔激活因子TAZ相互作用，調節(jié)成骨細胞分化。因此，實驗將 Taz siRNA 轉染到 PSPCs 中，并分析其向成骨細胞和軟骨細胞的分化。Taz 敲低抑制了 PSPCs 的骨軟骨形成相關基因表達和分化能力。此外，機械卸載抑制了 TAZ 在HU組 WT 小鼠愈傷組織中的核易位。這些結果表明，PC1-CTT 裂解促進了 TAZ 的核易位，促進了 PSPCs 的骨軟骨分化潛力。

最后，研究人員用 Zinc01442821 局部治療小鼠骨折部位 42 天，并研究其在卸載條件下對骨折修復的治療效果，發(fā)現(xiàn)Zinc01442821 增加了骨折部位的骨密度并改善了礦化愈傷組織的形成（圖3 A），并在 14 和 42 天的骨折部位出現(xiàn)明顯的硬愈傷組織（圖3 A-D）。與對照組相比，用 Zinc01442821 處理的小鼠表現(xiàn)出新生的編織骨大小和密度的顯著增加（圖3 E、F）。此外，Zinc01442821 處理促進了 PSPCs 的成骨分化（圖3 G）和軟骨基質形成（圖3 H），并增強 TAZ 的核易位（圖3 I、J）。這些數據表明，施用 Zinc01442821 可以緩解與機械卸載相關的骨延遲愈合或不愈合。

體外細胞測定還發(fā)現(xiàn) Pkd1 的敲低減弱了 Zinc0144282 對 PSPC 成骨分化的積極作用，這表明了Pkd1 的敲低削弱了 Zinc01442821 的治療效果，凸顯了 PC1 在 Zinc01442821 治療中關鍵的作用。

圖3    Zinc01442821促進PSPCs的骨軟骨形成，緩解卸載相關骨折不愈合。

圖4    圖形概要

總之，該研究結果表明，CTSK+ PSPCs 可以直接感知機械應力并通過 PC1-TAZ 軸操縱骨軟骨生成和骨愈合，這可能是促進骨愈合和礦化組織/器官中其他與機械應力相關疾病的有希望的治療靶點。

參考文獻：Liu R, Jiao YR, Huang M, Zou NY, He C, Huang M, Chen KX, He WZ, Liu L, Sun YC, Xia ZY, Quarles LD, Yang HL, Wang WS, Xiao ZS, Luo XH, Li CJ. Mechanosensitive protein polycystin-1 promotes periosteal stem/progenitor cells osteochondral differentiation in fracture healing. Theranostics. 2024 Apr 8;14(6):2544-2559. doi: 10.7150/thno.93269. PMID: 38646641; PMCID: PMC11024844.

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