IS-OGP：提升傳統(tǒng)顯微鏡在光遺傳學(xué)中的應(yīng)用

光遺傳學(xué)是一種利用光來(lái)控制活體組織內(nèi)細(xì)胞活動(dòng)的技術(shù)。這可以是從廣泛照射腦組織以刺激實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的特定活動(dòng)，到監(jiān)測(cè)單個(gè)神經(jīng)元水平的通路。光遺傳學(xué)的一個(gè)關(guān)鍵要求是能夠精確地將光定向到實(shí)驗(yàn)對(duì)象，主要是在顯微鏡下進(jìn)行。

許多生物過(guò)程是基于離子濃度梯度在兩個(gè)親水區(qū)域之間，通過(guò)脂質(zhì)膜的差異來(lái)進(jìn)行的。例如，線(xiàn)粒體中的能量是以質(zhì)子（pH）梯度的形式產(chǎn)生的，肌肉細(xì)胞的收縮是由鈉（Na+）和鈣（Ca2+）離子梯度介導(dǎo)的，而神經(jīng)脈沖的傳遞涉及鈉（Na+）和鉀（K+）離子的流動(dòng)。

幾十年來(lái)，研究人員在所謂的“膜片鉗”研究中使用微小機(jī)電探針研究和操縱這些電位；通常，微管電極插入細(xì)胞或?qū)ν饽ば纬擅芊狻６F(xiàn)在，光遺傳學(xué)領(lǐng)域?yàn)檫@個(gè)謎題的另一面帶來(lái)了光子解決方案，即操縱這些細(xì)胞間的電位差。

第一個(gè)光遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)利用了天然存在的、光激活的蛋白質(zhì)，稱(chēng)為視蛋白，用于充當(dāng)特定離子的泵。一旦實(shí)驗(yàn)原理被成功證明，研究會(huì)很快擴(kuò)展到一系列的通道視紫紅質(zhì)和其他類(lèi)別的基因編碼工具（例如，C1V1）。這些光遺傳激活劑為科學(xué)家提供了一種機(jī)制，可以在毫秒內(nèi)使用適當(dāng)波長(zhǎng)和強(qiáng)度的光來(lái)打開(kāi)或關(guān)閉目標(biāo)細(xì)胞（例如，肌肉細(xì)胞、大腦皮層神經(jīng)元）。

光遺傳學(xué)在生命科學(xué)研究中具有極其廣泛的應(yīng)用，從觀察孤立細(xì)胞的活動(dòng)，到刺激實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的特定行為，再到研究大腦皮層中的神經(jīng)通路。對(duì)于宏觀應(yīng)用，照明需求通常相對(duì)簡(jiǎn)單。在尺寸譜系的另一端，多光子激發(fā)顯微鏡使得在體內(nèi)以單個(gè)神經(jīng)元分辨率進(jìn)行三維研究成為可能。在這些JI*端情況之間，許多實(shí)驗(yàn)可以在常規(guī)光學(xué)顯微鏡下最*效地進(jìn)行，只要有一種方法可以準(zhǔn)確地將一個(gè)或多個(gè)輔助光源（激光、LED或過(guò)濾燈）對(duì)準(zhǔn)視野中的一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)。為了支持此類(lèi)工作，新一代的光機(jī)電模塊提供了一種成本效益高的方法，將一個(gè)可外部控制的次級(jí)光源集成到諸如蔡司（Zeiss）、尼康（Nikon）和奧林巴斯（Olymous）等領(lǐng)*xian制造商的傳統(tǒng)三目顯微鏡中。操作原理很簡(jiǎn)單（見(jiàn)圖1）：將45°分束器放置在顯微鏡主體（管）的無(wú)限空間中。具體來(lái)說(shuō)，二向色、帶通或其他分束器被固定在一個(gè)緊湊的滑塊組件中，該滑塊組件在顯微鏡主體和三目鏡頭之間機(jī)械地吻合。一旦將滑塊機(jī)制安裝在顯微鏡中，分光器就可以從顯微鏡的光學(xué)路徑中插入或撤出，甚至可以更換為另一個(gè)分光器，而無(wú)需任何機(jī)械干擾或拆卸。

圖1. 光學(xué)機(jī)械模塊，例如Siskiyou IS-OGP，提供了一種成本效益高的方法，用于將一個(gè)可外部控制的次級(jí)光源集成到傳統(tǒng)的三目顯微鏡中。一個(gè)45°的二向色鏡、帶通或其他分光器被固定在一個(gè)緊湊的滑塊組件中，該組件在顯微鏡主體和三目頭之間機(jī)械地嵌合。滑塊允許分光器無(wú)縫插入和從顯微鏡光路中撤出，甚至可以更換為另一個(gè)分光器。

從單模光纖耦合的準(zhǔn)直器輸入的準(zhǔn)直光通過(guò)一個(gè)精密的XY雙撓性支架橫向輸入到組件中（見(jiàn)圖2）。顯微鏡物鏡將結(jié)果光點(diǎn)聚焦在樣本平面上。光點(diǎn)直徑取決于光的波長(zhǎng)和物鏡的倍數(shù)；使用常規(guī)的20X物鏡，488nm的光通常被聚焦到大約5μm的極限光點(diǎn)直徑。在支架中調(diào)整準(zhǔn)直器可以使得使用20倍物鏡時(shí)光點(diǎn)直徑從5μm變化到50μm。

圖2.IS-OGP是Siskiyou公司的一個(gè)模塊化子組件，它將來(lái)自輸入單模光纖的光束校準(zhǔn)，并通過(guò)45°分光器將其引導(dǎo)至直立顯微鏡的視野中的任何位置。產(chǎn)生的光點(diǎn)具有可調(diào)直徑，并且可以通過(guò)機(jī)械（差動(dòng)螺釘）或自動(dòng)化執(zhí)行器精確定位或掃描。

緊湊型準(zhǔn)直器配置有標(biāo)準(zhǔn)的FC-female輸入插座，因此可以接受通過(guò)單模光纖傳輸?shù)娜魏喂庠础ｋp撓性jian*端/傾斜安裝裝置提供了簡(jiǎn)單調(diào)整聚焦點(diǎn)位置的功能——與基于雙軸平移的替代方法相比，背隙得到最小化。焦平面的微調(diào)靈敏度再次取決于物鏡的功率，但與顯微鏡筒長(zhǎng)無(wú)關(guān)。當(dāng)使用20X物鏡與本裝置標(biāo)準(zhǔn)配備的微分螺釘時(shí)，粗調(diào)的每轉(zhuǎn)大約為110μm，細(xì)調(diào)的每轉(zhuǎn)為9μm。此外，柔性支架接受電機(jī)驅(qū)動(dòng)器，適合那些希望實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制的人。

使用由多個(gè)子模塊組成的光學(xué)顯微鏡模塊的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是成本效益的靈活性。例如，分束器滑塊模塊可以單獨(dú)使用，以創(chuàng)建固定的、45°雙向通向顯微鏡無(wú)限空間的訪(fǎng)問(wèn)。這使得可以使用額外的目鏡、相機(jī)或其他成像設(shè)備；例如，帶有偏振或帶通濾光片的設(shè)備。

賓夕法尼亞大學(xué)Mahoney神經(jīng)科學(xué)研究所的 Minghong Ma 教授和 Wenqin Luo 使用這種新的模塊化設(shè)置進(jìn)行他們的一些研究。Ma和Luo的研究小組正在使用光遺傳刺激和貼片鉗感測(cè)相結(jié)合的方法，在離體組織中研究嗅覺(jué)系統(tǒng)和脊髓中不同細(xì)胞類(lèi)型是如何通過(guò)突觸連接的。他們使用470nm激光刺激表達(dá)ChR2的神經(jīng)元，并使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)監(jiān)測(cè)其他“記錄”細(xì)胞中的相應(yīng)活動(dòng)。

這些研究是在配備IS-OGP光遺傳學(xué)定位器的Olympus正置顯微鏡（型號(hào)BX61）下進(jìn)行的。Ma教授解釋說(shuō)：“這臺(tái)多功能顯微鏡是近十年的老設(shè)備，對(duì)于多個(gè)研究項(xiàng)目來(lái)說(shuō)是一個(gè)重要的共享資源。然而，對(duì)于光遺傳學(xué)的一個(gè)限制是它只有一個(gè)輔助光源輸入——一個(gè)配置用于熒光照明的后側(cè)端口。我們的工作需要將這個(gè)端口專(zhuān)門(mén)用于表層熒光目的。ISOGP提供了一種wan美的方法，可以在不干擾或損害顯微鏡的其他功能和能力的情況下，引入一個(gè)額外的激光用于光遺傳學(xué)。”

在Ma教授研究中的一個(gè)典型實(shí)驗(yàn)里，一個(gè)300到500μm厚的組織切片被放置在記錄室中，并使用標(biāo)準(zhǔn)的含氧溶液保持其活力。熒光顯微鏡用于尋找表達(dá)ChR2的神經(jīng)元軸突；然后使用差分干涉對(duì)比（DIC）成像來(lái)定位ChR2軸突旁的合適細(xì)胞。隨后，使用貼片鉗電極與該細(xì)胞接觸，以便觀察由于使用470納米激光光（通過(guò)IS-OGP模塊引入視野）選擇性刺激ChR2軸突而引起的膜電位變化。典型數(shù)據(jù)圖3所示。

圖3.嗅球（OB）神經(jīng)元接收來(lái)自嗅覺(jué)感覺(jué)神經(jīng)元的輸入，并表現(xiàn)出光激發(fā)的反應(yīng)。

(a) 一個(gè)OB切片顯示了共表達(dá)氣味受體M72和ChR2的嗅覺(jué)感覺(jué)神經(jīng)元的軸突（左），在另一切片下，熒光照明（右，上）和差分干涉對(duì)比（右，下）中，OB神經(jīng)元是可見(jiàn)的。

(b) 在電壓鉗制配置下（Vhold = -70 mV）從OB神經(jīng)元進(jìn)行全細(xì)胞記錄：激光刺激引起大的、向內(nèi)的突觸后電流，表明光敏感的嗅覺(jué)感覺(jué)神經(jīng)元與這個(gè)細(xì)胞形成了突觸。

產(chǎn)品特點(diǎn)

l 顯微鏡安裝方便

l 簡(jiǎn)單的光束控制

l 使用單模連接器光源

l 專(zhuān)為蔡司（Zeiss）、尼康（Nikon）和奧林巴斯（Olymous）顯微鏡設(shè)計(jì)