對于許多適應癥，細胞療法是一種越來越可行的治療選擇，尤其是對于已經用盡傳統治療方法的患者。大量的臨床活動和幾種自體、患者特異性療法的批準增加了行業需求，也突顯了生產工作流程中的瓶頸。必須解決這些瓶頸，以提高生產效率、安全性以及及時向患者交付。

在自體環境中，每個患者的健康狀況和人口統計數據轉化為一個細胞群體，這給隨后的細胞治療生產過程帶來了可變性。因為存在這種可變性，這意味著過程控制在確保藥品一致性方面的重要性。

一個重點領域是過程分析技術（PAT），這對于在整個生產過程和QC檢測中提供關鍵質量屬性（CQA）信息至關重要。實時過程反饋對于加強過程監控以確保生產成功至關重要，但關鍵過程反饋往往因檢測時間過長而延遲。

在最近的一次美國基因+細胞治療學會（ASGCT）在線會議上，Bristol Myers Squibb的Rich Rogers概述了基于質譜的過程分析策略，以支持細胞治療過程的開發和優化。Rogers概述了PAT的分析需求和儀器要求，以及基于MS的PAT如何有望成為一種強大的技術，以克服當前分析工具所面臨的許多挑戰。

CAR-T療法的屬性監測

Rogers首先概述了BMS用于開發其基于自體慢病毒的CAR-T平臺的平臺。在生產自體CAR-T療法時，這一過程始于使用白血病細胞采集患者的細胞。一旦收獲了單核細胞，在細胞療法可以重新應用到患者體內之前，需要采取許多步驟來分離、激活、改造和擴增T細胞。目前，BMS使用PAT來監測細胞增殖（即活率、細胞密度），并在每個階段使用流式細胞法來進行T細胞和雜質分析（即污染細胞類型的存在）。雖然這些工具的數據是足夠的，但有機會對細胞健康和代謝狀態進行更深入的監測還是有必要的，因為這很可能會影響最終產品的療效。

實施PAT的可能性是無限的，適用于生產過程的各個方面。PAT可用于確定工藝杠桿，以確保產品的一致性，并提高上游（即溫度、pH、葡萄糖、氨基酸、細胞活率和代謝物）和下游（即工藝相關雜質）的生產成功率，以及量化最終產品中的CQA（即純度、效力、安全性和CAR頻率）。

Rogers概述了使儀器適用于過程PAT的一些關鍵功能：

•儀器占地面積：生產潔凈間通?？臻g有限，因此需要考慮儀器尺寸

•資本投資：與研發儀器不同的成本考慮

•生物測定的數量：可以進行多屬性測試的儀器

•低體積樣品要求：尤其是在生產過程中，通常無法采集大體積樣品進行過程中檢測

•運行分析的時間：從采樣到得到數據的時間應該很快；檢測時間對于提供相關過程反饋至關重要

•技術專業知識要求低：操作過程中儀表所需的培訓應較低，且無需專家參與

•數據速度：盡可能短/接近實時，對生產過程產生最大效益

基于質譜的PAT策略

Rogers詳細介紹了BMS為過程分析開發的基于MS的非目標和目標PAT策略。MS是一種技術，用于在單克隆抗體等大分子治療中生成穩健且可重復的數據。然而，將這一策略應用于涉及數千種蛋白質的細胞治療會帶來需要解決的障礙。一個障礙是作為CAR-T療法基礎的細胞的復雜性。大分子治療只需要純化單克隆抗體，而細胞治療可能需要考慮數千種蛋白質。因此，傳統的大分子MAM（Multiple Attribute Methodology）方法不能直接應用于細胞治療。

基于蛋白質組學的PAT

Rogers還描述了BMS使用的基于MS的細胞表面蛋白質組學方案，該方案在整個生產階段對T細胞進行非靶向細胞表面分析。細胞表面蛋白用生物素標記，然后進行細胞裂解、標記的鏈霉親和素富集、酶促消化和MS分析。

這種非靶向方法是有利的，因為它不需要特異性靶向細胞表面蛋白的試劑（與流式細胞法方法不同），這提供了T細胞表面蛋白組成的無偏見的全局視圖。

過程殘留和分泌蛋白監測是另一個正在開發多屬性靶向蛋白質組學方法來取代ELISA的領域，ELISA受到開發靶向特異性檢測試劑的需要的限制。這種MS方法是高度敏感的，因此允許同時對數百個蛋白質靶標進行多重定量。從色譜分離、片段化和Orbitrap MS分析中選擇靶向肽，提供了過程殘留物和T細胞分泌蛋白的定量檢測。

在總結這些蛋白質組學方法時，Rogers評論道，雖然他們對結果的準確性感到鼓舞，但這種方法仍需要努力，以滿足他在演講早些時候概述的PAT要求。MS儀器占地面積大，成本高，人員培訓廣泛，需要提高數據傳輸速度，以便在生產運行期間實時向實驗人員提供及時的信息。

基于靶向代謝組學的PAT

在演講的后半部分，Rogers使用REBEL分析儀（908 Devices）專注于基于代謝組學的靶向PAT。該臺式設備通過采集來自生物反應器的培養基反應液來對T細胞進行在線代謝分析。細胞分泌和代謝產物分析可以提供關于細胞健康和效力的有價值的信息。BMS計劃在過程開發的每個階段利用REBEL分析儀來實施代謝組學的研究。這包括慢病毒載體的組建以及T細胞增殖過程本身，其中REBEL分析儀已被用于提供關于T細胞健康和代謝狀態的有價值的信息。

REBEL分析儀滿足PAT的所有要求：

•占地面積?。ㄎ⒉t大?。?，成本合理

•同時監測30多種分析物

•只需要10μl樣品體積

•移液技能是技術要求

•所需培訓最少

•檢測時間快-大約~7分鐘/樣本

•快速獲取數據：集成軟件執行分析并自動生成報告，該報告可以導出為與LIMS、PIMS兼容的CSV或PDF文件

在方法和儀器評估過程中，使用REBEL對同一生物反應器運行的三個單獨樣品進行5次重復，以證明高重復再現性，如下圖1所示。

在結束演講時，Rogers強調了PAT對提高細胞療法的工藝理解和生產成功的重要性。對PAT和創新技術的投資正在推動當前方法的通量和準確性極限，Rogers表示，他認為基于MS的方法在靶向和非靶向蛋白質組學和代謝組學表征方面都有很大的機會。在整個細胞治療制造過程中提供對T細胞的廣譜、全局評估。

在研討會的下一次演講中，908 Devices的產品經理Kerin Gregory分享了如何使用REBEL分析儀通過對細胞培養基（即氨基酸、維生素、生物胺）的快速成分檢測來實現及時和有用的過程分析。細胞培養基為離體培養的細胞提供關鍵營養，并對細胞生長、生產力和后續治療的功能有直接影響。深入的培養基分析可以幫助深入了解營養的消耗，以促進培養基優化工作，從而提高CQA。

營養成分分析和培養基優化

特別是對于病毒載體的生產，滿足臨床和商業目標的需求需要提高病毒滴度。因為克隆差異會影響宿主細胞（即HEK293）的代謝，培養基/反應液成分分析可以更好地了解宿主細胞的需求，并為優化培養基以提高病毒滴度提供了機會。雖然市場上有許多商業培養基配方，但相對濃度和組成成分可能差異很大，如下圖2所示，這些不同的培養基選擇可能對病毒載體的滴度和完整性產生重要影響。REBEL也可用于監測所選配方中的批次差異，以確保一致性和重復性。

此外，研究表明，T細胞培養基需要幾種關鍵氨基酸來調節體外激活和擴增，它們在CAR-T細胞的代謝準備狀態和引入體內腫瘤微環境后的抗腫瘤功效中發揮作用。這強調了細胞培養基成分對細胞生長、代謝和生產力的深遠影響。

血清置換

Gregory補充道，由于兩個原因，細胞治療行業已經從含血清的培養基配方轉向無血清：1）血清存在批次間的差異；2）除了在臨床應用中的免疫原性風險之外，血清還具有潛在的被外來成分污染的風險?；瘜W限定培養基（CDM）的開發代表了一個領域，在這個領域，REBEL可以用來表征成分，用于培養基的的配方工作。REBEL的動態范圍為5-100μM，可準確檢測低濃度的氨基酸和其他營養物質。與其他定量方法不同，分析不受血清蛋白存在的影響。