在微生物研究，尤其是細菌學中，對菌體計數是一項最基本的需求。常規的計數方法主要是國家標準推薦的平板計數法和顯微鏡計數法，但它們耗時長、誤差大，且平板法只能計數活菌。

近年來，隨著熒光染料、結構光學和流式細胞儀技術的不斷發展，流式細胞術檢測細菌等微生物成為可能。與傳統檢測方法相比，其具有靈敏、快速、高效、精確的優勢，流式細胞術已經成為微生物研究中的一個重要工具，在單細胞層面對細菌結構和功能的多項參數進行更深層的分析，以研究細菌的異質性和鑒定細菌種屬。

本方案以大腸桿菌為例，介紹層浪流式細胞儀如何評估活菌比例和計數。

——實驗背景——

膜的完整性評估是細菌活力的重要評價手段，通常使用膜滲透性和非滲透性熒光染料來進行活力測試，目前比較常見的染料是SYTO 9/PI。

SYTO 9 作為一種可滲透的綠色熒光核酸染料，被動擴散進入細胞內，既可以進入細胞膜完整的細菌中，也可以進入細胞膜受損的細菌中，與核酸染料結合。而紅色熒光核酸染料PI只能進入不完整細胞膜的細菌中。當SYTO 9和PI同時加的時候，PI染料進入膜內，會導致SYTO 9熒光染料的降低。因此，具有完整細胞膜的細菌呈現綠色，而膜不完整的細菌呈現紅色。


圖1：SYTO 9/PI細菌活力測定法原理示意圖

——樣本處理——

1. 收集對數生長期的大腸桿菌，10000g，5min，離心洗滌，取細胞沉淀重懸于0.22um過濾的無菌PBS中；

2.進行細菌計數，為后續染色做準備；

3. 取4個流式管，標記為空白組，SYTO 9和PI單染組，樣本組。每個試管加100ul細菌懸液，保證細菌數在10⁶-10⁷左右。

——樣本染色——

1. 根據廠家試劑盒建議，單染組分別加1ul SYTO 9或1ul PI，樣本組加1ul SYTO 9和1ul PI，加PBS至988ul。渦旋，室溫避光孵育15min；

2. 充分渦旋微球，每管分別加10ul，每份樣本中體系為1000ul；

3. 設置參數，用層浪FongCyte流式細胞儀采集信號，SYTO 9（Max Ex/Em=485/498nm）用FITC通道檢測，PI（Max Ex/Em=535/617nm）用PerCP通道檢測，兩個通道光譜重疊小，補償易調節。

——數據分析——

1. 細菌比較小，選擇對數模式分析。設置合適的電壓，使細菌群信號在流式圖中間清晰地呈現。設置合適的閾值，很大程度減少背景噪音。此實驗中，設置的是FSC和FITC雙閾值；

2. 根據FSC和SSC，圈出主細菌，右上角的一群是微球（圖2）；

3. 從主細菌中，選擇SYTO 9和PI，紅光區域的代表死菌，綠光區域的代表活菌（圖3）。

——總結——

1. 原核生物平均直徑在1um左右，需要挑選合適的流式細胞儀。層浪的流式細胞儀檢測直徑在0.1-50um，除大腸桿菌外，還可以檢測葡萄球菌、酵母、浮游生物、益生菌等；

2. 層浪流式細胞儀可以獲得體積法絕dui計數，跟微球法結果有較高的一致性，節約實驗經費；

3. 細菌活力染色實驗對管路的潔凈度要求高，層浪流式細胞儀每管樣本間采樣針自動清洗，攜帶污染率為0.05%，能夠獲得更加準確的結果。

數據來源 : 廣州某實驗室

層浪： 您好，可以采訪下您近期使用層浪流式細胞儀的感受嗎？

客戶： 可以的。

層浪：  在層浪的儀器上，您們日常都做哪些樣本？

客戶：  我們實驗室開展多種流式實驗，在微生物方面，除了細菌，還做酵母、益生菌檢測等。

層浪：  您對于層浪的儀器，有哪些使用感受和反饋嗎？

客戶：  我們之前用平板法培養細菌進行計數，這種方式只能培養活菌，通常耗時3天左右，而流式細胞術對活菌和死菌都可以計數，比平板法的計數結果會高一些，更準確一些，而且靈敏、檢測速度快、時間短，極大地提高了我們出數據的效率，我們現在逐漸用流式替代平板法了。

層浪：  確實，現在流式細胞儀在微生物研究中的作用越來越廣泛了。

客戶：  我們實驗室之前有一款進口的流式細胞儀，現在使用貴司的儀器，非常喜歡您們的軟件！中文的界面，功能鍵直觀，而且操作簡單。細菌實驗對儀器的清潔度要求高，還要避免管路之間的交叉污染，之前我們是上完一個樣本，再上一管水，進行反沖。而您們的儀器每個樣本之間能夠進行采樣針清洗，免去了我們每管樣本手動清洗的麻煩。做普通清洗和深度清洗也很方便，使用的清洗液用量也不大。

層浪：  非常感謝您的反饋。層浪會繼續努力，用心服務每一位客戶。


圖4：層浪生物FongCyte™3光14色流式細胞儀

參考文獻：

1、劉新星,霍轉轉.流式細胞術在細菌快速檢測中的應用；微生物學通報。DOI:10.13344/j.microbiol.China.130041.

2、鄧穎,基于流式細胞術的SYTO 9/PI細菌活性判定方法優化及其機理;暨南大學碩士學位論文.

3、Philipp Stiefel, Sabrina Schmidt-Emrich,Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.DOI 10.1186/s12866-015-0376-x.

4、S M Stocks,Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight.doi: 10.1002/cyto.a.20069.

5、Martin G. Wilkinson,Flow cytometry as a potential method of measuring bacterial viability in probiotic products: A review.//doi.org/10.1016/j.tifs.2018.05.006.