生物制品是指以微生物、寄生蟲、動物毒素、生物組織作為起始材料，采用生物學工藝或分離純化技術制備，并以生物學技術和分析技術控制中間產物和成品質量制成的生物活性制劑，包括菌苗、疫苗、毒素、類毒素、免疫血清、血液制品、免疫球蛋白、抗原、細胞因子、激素、酶、發酵產品、單克隆抗體、DNA重組產品、體外免疫診斷制品等。由于其特殊的性質，生物制品的質量控制至關重要，國家規定應當對生物制品的生產過程和中間產品的檢驗進行特殊控制，為響應這一要求，一系列生物制品生產研發過程中相關雜質的檢測試劑盒誕生，大致可分為兩大類，一類是檢測細胞來源的污染物，例如來自包裝細胞系或細菌的宿主細胞蛋白和DNA，另一類則是檢測生產中使用的輔助病毒、質粒DNA、牛血清、核酸酶、蛋白酶、抗生素等物質。

細胞來源污染物檢測

1、宿主細胞DNA/DNA片段殘留檢測

生物制品中的重組蛋白藥、抗體藥、疫苗等產品是用連續傳代的動物細胞株表達生產，雖然經過嚴格的純化工藝，但產品中仍有可能殘余宿主細胞DNA，不同宿主細胞殘留的DNA帶來的潛在威脅并不相同，盡管它們有著相同的基本結構單位，但其片段長度不同，以不同的物理形式存在，進入人體后可造成多種多樣的后果，如致癌性、感染性等。因此從安全角度，在生物制品的生產工藝對殘留DNA進行檢驗驗證是有必要的。

《中國藥典》、《美國藥典》和《歐洲藥典》均提及用qPCR法對DNA殘留量進行測定。TaqMan®熒光探針是一種寡核苷酸探針，其5’末端攜帶熒光基團（報告基團），如 FAM、TET、VIC等，3’端攜帶淬滅基團，如 TAMRA、BHQ1等。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一條特異性的熒光探針，探針完整時，熒光基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收。PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統（熒光定量PCR儀）可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成同步。該方法具有特異性強、靈敏度高等特點，在目前生物制藥細胞核酸殘留檢測中被廣泛使用。

表 《中國藥典》2020版部分疫苗生物制品殘留DNA標準

2、宿主蛋白（HCP）殘留檢測

宿主蛋白即由宿主細胞產生的蛋白，包括目的蛋白和宿主細胞本身的蛋白，它的存在可能誘發不良免疫反應，也可能導致藥效發生變化，因此需要對原料藥和下游純化過程（DSP）中間體中的HCP進行表征和量化。多國藥典規定酶聯免疫法（ELISA）作為HCP定量方式，《中國藥典》2020版明確規定CHO細胞殘余蛋白占總蛋白含量要保持在0.05%以下。

圖 Absin CHO HCP ELISA Kit（abs590005）快速操作流程

工藝雜質殘留檢測

1、培養添加劑殘留檢測

細胞培養是生物制品生產過程中經常用到的手段，牛血清更是被廣泛使用，為細胞生長提供必須的營養成分，BSA則是在牛血清中大量存在，然而BSA作為外源性蛋白如果跟隨藥物產品進入人體，將引發嚴重的免疫反應并有可能影響藥物效果，因此《中國藥典》2020版對各種疫苗BSA的殘留量都進行了明確的規定，基本是不高于50ng/mL或者不高于50ng/劑，并且藥典也推薦了酶聯免疫吸附法用于BSA的含量測定。

除了牛血清外，各類抗生素亦是細胞培養過程中的添加劑，如卡那霉素、慶大霉素等，ICH（人用藥品注冊技術要求國際協調會）將生物制品中的殘留抗生素列為工藝相關雜質，要求“通過研究證明其在工藝中可有效控制或去除，并達到可接受的水平”，《中國藥典》2020版明確規定對疫苗等預防類產品采用酶聯免疫法測定抗生素殘留，應<50ng/劑。

2、Protein A殘留檢測

Protein A有著與某些免疫球蛋白（特別是IgG）的Fc部分的高親和力，因此Protein A親和層析柱被廣泛應用于抗體類藥物的分離純化，但是在使用過程中，由于待純化物中存在蛋白水解酶，會水解Protein A，導致部分Protein A脫落并與抗體結合殘留在洗脫液中，Protein A具有免疫原性，若進入體內可能引起不良免疫反應，因此對于殘留量需要做質控。

3、膠原酶I型殘留檢測

膠原酶廣泛用于將組織消化成單細胞，消化得到的單細胞被用于進一步生產生物制品，生物制品生產相關法規中明確了細胞培養相關材料檢測的必要性，故膠原酶的殘留量檢測也愈發引起重視。

4、內毒素檢測

內毒素是一種脂多糖，來自革蘭氏陰性細菌的細胞壁，會在細菌死亡或自溶后被釋放，當內毒素進入生物體，可能引起發熱反應，因此也是影響生物制品安全性的重要因素之一，《中國藥典》2020版規定用鱟試劑進行內毒素檢測。

鱟試劑是一種從動物鱟的血液中提取的生物試劑，能夠和內毒素發生反應，產生凝集沉淀，再應用凝膠法或光度測定法檢測生物制品中內毒素的含量，為了符合可持續發展的原則，科學家們研發出了重組鱟試劑，以替代傳統鱟血提取物，從操作流程與分析方法上做到了無感替代。

圖 鱟與鱟試劑檢測原理

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[M].北京：中國醫藥科技出版社，2020:1088.

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