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國自然與CNS頂刊的偏愛— —“類器官”，再次登頂Nature Methods！
類器官（Organoid）是十四五國家重點研發計劃中6個重點專項之一，是國家科技部的重點關注項目。近年來相關的項目和文章也迅速升溫，僅過去的2023年上半年，“Organoid”相關文章就有兩千多篇，遠超前幾年同期水平，意味著該領域的研究熱度持續上升。
國自然基金申報 “內卷”趨勢越來越顯著，而類器官（Organoid）作為前沿熱點技術之一，近年來備受申請人和評審專家們的關注。類器官相關的課題和項目在申請國自然上具有得天獨厚的優勢。尤其是2018年以來，類器官相關方向，連續幾年被國自然申報指南列為推薦項目的研究方向。作為具有高適用度的體外模型之一，類器官從最初的體外模型補充參考的工具，逐漸開始“挑國自然大梁”。
國自然基金申報 “內卷”趨勢越來越顯著，而類器官（Organoid）作為前沿熱點技術之一，近年來備受申請人和評審專家們的關注。類器官相關的課題和項目在申請國自然上具有得天獨厚的優勢。尤其是2018年以來，類器官相關方向，連續幾年被國自然申報指南列為推薦項目的研究方向。作為具有高適用度的體外模型之一，類器官從最初的體外模型補充參考的工具，逐漸開始“挑國自然大梁”。
PubMed類器官相關文章數量趨勢
近期，一篇以《人腦類器官中的譜系記錄》（Lineage recording in human cerebral organoids）為題的類器官文獻登上Nature Methods。該文獻結合單細胞測序、空間轉錄組以及4D光片顯微成像技術（長時間高分辨類器官光片顯微鏡），實現了人類大腦類器官的譜系記錄。
近年來，人類誘導多能干細胞iPSCs衍生的類器官，為研究人體器官發育提供了模型。單細胞測序技術能夠高度鑒定系統內細胞狀態的描述，然而，目前還沒有很好的方法直接測量細胞譜系關系。譜系偶聯scRNA-seq允許在復雜組織和其他細胞分化場景中更好地注釋細胞命運規范和軌跡推斷。長時間高分辨類器官光片顯微鏡基于圖像的方法，為捕捉全面的發育動態提供了一種可視化方法。因此，譜系偶聯單細胞轉錄組學和長時間高分辨類器官光片顯微鏡為記錄和理解iPSCs建立的類器官系統的譜系動力學提供了全面的解決方案。
長時間高分辨類器官光片顯微鏡-LS2是一款全新光片成像平臺，可實現活細胞的長時間、高分辨、高通量、多樣品同時成像，非常適合對直徑達300 μm的光敏樣品（如卵母細胞，胚胎和類器官）進行長期實時高時空分辨率和低光毒性的觀察與成像。這一成熟的長時間實時類器官成像技術也為本實驗提供了關鍵數據支撐。
作者建立了一個雙通道細胞譜系記錄系統(iTracer) 來了解腦類器官腦區域化過程中的譜系動力學。系統設置從最原始的iPSCs樣本庫中開始跟蹤克隆，同時也允許使用誘導疤痕在不同的時間點進行譜系記錄，以解決動力學與神經元命運之間建立關系尚不明確的問題。該系統既可以進行克隆分析，也可以探索細胞命運建立的時間動態，避免了多輪標記。在腦類器官發育的時間過程中進行的單細胞轉錄組分析證實，在單個類器官中形成了不同的腦區域，類器官中的腦區域特征與發育中的小鼠大腦空間原位地圖集的對應區域非常相似。使用iTracer來探索在腦類器官模式和神經發生過程中與分子特征相結合的譜系，并表明該系統與空間轉錄組學兼容。
圖1 iTracer Sleeping Beauty示意圖并且揭示了人類大腦類器官細胞命運的克隆性
為了將分子狀態、細胞譜系和位置信息聯系起來，作者建立了“空間iTracer”，它使用空間轉錄組測序技術來測量基因表達和iTracer讀取結果。數據表明，在腦類器官發育過程中，相關細胞傾向于聚集在類器官的同一區域，接收相似的圖案信號，因此平均而言被限制在相同的大腦區域身份中。iTracer和空間iTracer共同揭示了腦類器官不同腦區細胞克隆的富集，這可以追溯到初始化EB 內的克隆。
圖2 空間iTracer連接腦類器官的譜系、分子狀態和位置信息
為了直接測量神經外胚層到神經上皮階段發育中的類器官的譜系動力學和克隆的空間積累，作者使用4D光片顯微成像技術（長時間高分辨類器官光片顯微鏡）建立了發育中的腦類器官的長期實時成像(圖3a)。簡單地說，作者生成了含有5% iPSCs的類器官，其細胞核被FUS-mEGFP熒光報告標記，將EB嵌入成像室的Matrigel中，并在神經誘導培養基中培養，類器官使用Viventis Microscopy開發的LS1 Live光片顯微鏡成像，使用X25物鏡，每2 μm獲得連續z步，共150步。采集幀率為30分鐘，總共100小時(200幀)用于跟蹤。并跟蹤發育 65-100小時(圖3b)。隨著EB的生長和發育，觀察到幾個管腔的形成，每個管腔都可以在三維上跟蹤(圖3c)。
圖3 腦類器官發育的長時間高分辨類器官光片顯微鏡4D成像
在整個記錄時間內，作者使用Mastodon直接跟蹤單個細胞核的譜系，這是一個允許在大型4D數據集中半自動跟蹤和管理細胞核譜系的方案(圖3d,e)。他可視化了源自原始細胞核的子細胞的空間分布，稱之為譜系1 (L1)，并生成了100小時增殖后的譜系樹(圖3f)。一個細胞周期的平均持續時間估計為17.3小時。作者觀察到，在整個記錄時間內，L1仍然局限于腔內的同一區域(圖3d)。跟蹤了另外三個核，其中兩個核與L1 (L2-L3)在相同的管腔區域相鄰，第三個核(L4)位于EB中一個截然相反的未來管腔區域(圖3g)。作者量化了每個樹之間的空間距離，并檢查了類器官3D空間內所有子細胞的分布(圖3g-i)。在65小時的過程中，初始化細胞核平均產生13個后代細胞核，它們都填充在擴大的類器官中，但在空間上仍然局限于親本管腔，表現出有限的遠離其譜系成員的遷移(圖3g-i)。這些結果表明，克隆的早期空間排列隨后的局部擴增導致腦區域的不同譜系組成，這證實了之前基于iTracer的類器官腦區域克隆性觀察(圖3j)。
腦類器官發育的長時間高分辨類器官光片成像視頻
另外，作者還使用iTracer來確定細胞在腦類器官發育過程中何時限制了它們的命運。研究者使用譜系記錄器的兩個通道(在EB初始化和發育過程中誘導的疤痕中引入的條形碼)以及單細胞轉錄組來構建命運映射的全類器官系統發育。使用iTracer以高分辨率評估不同腦類器官區域中祖細胞到神經元譜系的可變性。為了實現深層譜系采樣，他們對200 μm iTracer類器官切片的兩個微解剖外周區域進行了譜系偶聯單細胞轉錄組學。
作者整合了靜態序列標記和基于CRISPR 技術的動態序列標記，可用于標記起始時間點的不同干細胞，也包括基于 CRISPR 編輯系統的動態序列標記，結合帶有可誘導 Cas9 蛋白基因的干細胞，即可在特定時間點產生額外的隨機突變，從而得到第二層細胞譜系信息。通過使用4D光片顯微成像技術（長時間高分辨類器官光片顯微鏡），對稀疏核標記的大腦類器官進行追蹤觀察。而在此基礎上，通過在不同時間點引入動態序列標記，還可得到大腦類器官中不同細胞類型、特別是不同類型神經元的命運決定關鍵時間點，并對同一多能干細胞產生的不同后代神經元的分化情況進行比較。進而得出在分裂分化過程中，大腦類器官的細胞并未發生顯著的細胞遷移，因而其后代細胞呈聚集分布，并在類似的微環境作用下，被誘導為同樣類型的神經元。
未來，iTracer以及4D光片顯微成像技術（長時間高分辨類器官光片顯微鏡）的聯合應用將成為了解人類類器官系統發育障礙背后的突變影響的有力方法。
參考文獻：
[1]. He et al., Lineage recording in human cerebral organoids. Nature Methods
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