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熒光光譜儀在吸收紫外和可見電磁輻射的過程中，分子受激躍遷至激發電子態，大多數分子將通過與其它分子的碰撞以熱的方式散發掉這部分能量，部分分子以光的形式放射出這部分能量，放射光的波長不同于所吸收輻射的波長。
熒光光譜儀主要包括光源、激發單色器、樣品池、熒光單色器及檢測器等主要部件。
1.光源
早期的熒光分光光度計，配有能發生很窄汞線的低壓汞燈。使用高壓汞燈，譜線被加寬，而且也存在高強度的連續帶。然而，一個完整的激發光譜的測定需一種能發射從可見到紫外范圍的較高強度的光輻射的燈。氙弧燈能適于此條件，因此，它是目前在熒光分光光度計中廣泛使用的光源。
2.單色器
單色器的作用是把光源發出的連續光譜分解成單色光，并能準確方便地“取出”所需要的某一波長的光，它是光譜儀的心臟部分。單色器主要由狹縫、色散元件和透鏡系統組成，其中色散元件是關鍵部件。色散元件是棱鏡和反射光柵或兩者的組合，它能將連續光譜色散成為單色光。
(1)棱鏡單色器
棱鏡單色器是利用不同波長的光在棱鏡內折射率不同將復合光色散為單色光的。棱鏡色散作用的大小與棱鏡制作材料及幾何形狀有關。常用的棱鏡用玻璃或石英制成。可見分光光度計可以采用玻，它適用于紫外、可見整個光譜區。
(2)光柵單色器
光柵作為色散元件具有不少的優點。光柵可定義為一系列等寬、等距離的平行狹縫。光柵的色散原理是以光的衍射現象和干涉現象為基礎的。常用的光柵單色器為反射光柵單色器，它又分為平面反射光柵和凹面反射光柵兩種，其中常用的是平面反射光柵。光柵單色器的分辨率比棱鏡單色器分辨率高(可達±0.2nm)，而且它可用的波長范圍也比棱鏡單色器寬，且入射光80%的能量在一級光譜中。近年來，光柵的刻制復制技術也在不斷地改進，其質量也在不斷的提高，因而其應用日益廣泛。
(3)狹縫
狹縫是單色器的重要組成部分，直接影響到分辨率。狹縫寬度越小，單色性越好，但光強度也隨之減少。
3.樣品池
熒光儀用的樣品池需用低熒光的材料制成，通常用玻璃和石英材料，形狀以方形和長方形為宜。
4.檢測器
主要有硒光電池、光電管和光電倍增管等。目前來說由于熒光的強度較弱，一般以光電倍增管作檢測器。選擇光電倍增管要考慮響應波長、靈敏度和噪聲水平等。藍敏管對蛋白質、核酸的測量適用，而紅敏管則適用于熒光染料檢測。
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