隨著技術(shù)的，內(nèi)毒素檢測(cè)方法也從初的兔熱原檢測(cè)法（RPT）發(fā)展到鱟試劑檢測(cè)法(LAL/TAL)，再到如今的重組因子C(rFc)法，經(jīng)歷了從體內(nèi)到體外，從少量到通量，從緩慢到快速的逐步發(fā)展更替，來(lái)不斷滿(mǎn)足行業(yè)發(fā)展的需求。

圖1內(nèi)毒素檢測(cè)方法發(fā)展史

近年來(lái)，重組C因子內(nèi)毒素檢測(cè)法以其快速、簡(jiǎn)單、非動(dòng)物源等特點(diǎn)受到越來(lái)越多的關(guān)注，有望替代鱟試劑，成為內(nèi)毒素檢測(cè)的主要方法。我們將從4個(gè)方面論述了這一替代趨勢(shì)的必然性：

• 從原理角度看，LAL和rFC都能用于內(nèi)毒素檢測(cè)

• 重組生物技術(shù)的發(fā)展必然帶來(lái)檢測(cè)方法的革新

• 對(duì)rFc檢測(cè)法在應(yīng)用中所面臨的阻力的深度理解

• 對(duì)rFC法接受度的逐步增長(zhǎng)及法規(guī)和監(jiān)管狀態(tài)加持

圖2rFC重組因子檢測(cè)法應(yīng)用的四大支柱

1）LAL既定效用；2）重組技術(shù)的發(fā)展；3）對(duì)面臨阻力的深度理解；4）接受度的逐步增長(zhǎng)

從工作原理上看，LAL和rFC都能用于內(nèi)毒素檢測(cè)

從原理上看，rFC方法的發(fā)明是基于對(duì)鱟試劑法內(nèi)毒素檢測(cè)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)的通路理解。生物化學(xué)家表征了鱟凝血級(jí)聯(lián)中的蛋白質(zhì)成分，系其血細(xì)胞和變形細(xì)胞中的一系列絲氨酸蛋白酶（C因子、B因子、G因子和凝固酶原、凝固蛋白原）[1-2]，這些絲氨酸蛋白酶負(fù)責(zé)在內(nèi)毒素存在時(shí)的鱟血液凝固（圖3），為行業(yè)內(nèi)從凝膠法檢測(cè)發(fā)展到動(dòng)態(tài)濁度法、動(dòng)態(tài)顯色法，之后發(fā)展到rFC方法提供了科學(xué)依據(jù)。同時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品CSE/RSE和標(biāo)準(zhǔn)的建立也為包括rFC方法的定量檢測(cè)打好了良好基礎(chǔ)。

圖3鱟試劑內(nèi)毒素檢測(cè)原理

重組生物技術(shù)的發(fā)展必然帶來(lái)檢測(cè)方法的革新

自1982年，禮來(lái)公司生產(chǎn)出了個(gè)商業(yè)化重組人胰島素Humulin®以來(lái)，越來(lái)越多的治療性大分子被開(kāi)發(fā)，也給生物技術(shù)行業(yè)帶來(lái)了一股新的力量。多年來(lái)，科學(xué)家一直在試圖生產(chǎn)出一種可持續(xù)、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)的人工合成內(nèi)毒素識(shí)別因子,保護(hù)鱟資源。

隨著對(duì)凝血級(jí)聯(lián)酶的認(rèn)知不斷積累，科學(xué)家們對(duì)內(nèi)毒素敏感的絲氨酸蛋白酶因子C進(jìn)行了基因工程改造。從開(kāi)始了解C因子的生化性質(zhì)，到使用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行克隆，并在各種宿主（細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞）中表達(dá)全功能重組因子C蛋白，歷經(jīng)了15年[3-5]，終確定重組C因子(rFC)的多功能結(jié)構(gòu)域，使其成為一種具有酶活性的前體，識(shí)別和結(jié)合內(nèi)毒素后表現(xiàn)出催化活性。

rFc法只需一步即可酶切熒光底物產(chǎn)生熒光，并根據(jù)底物酶切的量來(lái)反饋內(nèi)毒素含量，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R原則：減少，替換，優(yōu)化，以及第四個(gè)“R”原則，即內(nèi)毒素檢測(cè)的重現(xiàn)性。因此，采用rFC代替LAL的優(yōu)勢(shì)是顯而易見(jiàn)的。

對(duì)rFC檢測(cè)法在應(yīng)用中所面臨阻力的深度理解

圖4內(nèi)毒素檢測(cè)方法及原理 rFC是單組分，單步驟敏感特異的內(nèi)毒素檢測(cè)方法

在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，藥品和診斷產(chǎn)品受到高度監(jiān)管，采用可靠的LAL內(nèi)毒素檢測(cè)替代方法，例如rFc方法，對(duì)水、原材料和過(guò)程樣品的測(cè)試都非常重要，因?yàn)樘娲椒ǖ氖褂每梢源蠹s節(jié)約90%的鱟試劑使用。近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，盡管LAL檢測(cè)也存在一些問(wèn)題，制藥公司和醫(yī)療保健行業(yè)仍在很大程度上依賴(lài)于LAL，直到2004年，rFC方法才商業(yè)化。

但是，從RPT到LAL，從LAL到rFC，內(nèi)毒素檢測(cè)方法的更替都是基于行業(yè)發(fā)展的需求，縱觀歷史，都需要一定的時(shí)間，需要行業(yè)的反復(fù)論證和實(shí)踐檢驗(yàn)。

迄今為止，rFC檢測(cè)方法認(rèn)可度也算是在逐漸提高，也是一種久經(jīng)考驗(yàn)的LAL檢測(cè)補(bǔ)充或替代方法。不僅僅具有“3S”優(yōu)勢(shì)Scientific characterization（可靠）、Sensitivity（靈敏）和Specificity（特異），還具有易于被大規(guī)模、批量、自動(dòng)化生產(chǎn)，批間一致性有保障，不受G因子旁路干擾等特點(diǎn)，更有利于制藥公司獲得、可靠檢測(cè)結(jié)果。

rFC的未來(lái)之路——法規(guī)和監(jiān)管狀態(tài)（美國(guó)、歐盟、中國(guó)）

多年來(lái)，科學(xué)家們一直設(shè)想將鱟的先天免疫研究結(jié)果應(yīng)用于生物技術(shù)、制藥和人類(lèi)保健行業(yè)。C因子和許多其他進(jìn)化保守的分子已被確定為在免疫防御、抗菌作用和治療敗血癥方面具有實(shí)用性，LAL也應(yīng)該重點(diǎn)用于拯救生命和提高生活質(zhì)量的分子研究[6-7]。基于rFC的內(nèi)毒素檢測(cè)的應(yīng)用已得到研究應(yīng)用的支持，緩解了潔凈技術(shù)中對(duì)鱟的需求。禮來(lái)公司采用rFC 進(jìn)行藥物質(zhì)量控制，其中四個(gè)已成功獲得FDA的認(rèn)可，證明了rFC用于注射藥物安全性檢測(cè)的可靠性和價(jià)值[8-9]。

從資源可及性角度看，鱟的持續(xù)捕撈也非常不明智，它會(huì)給整個(gè)醫(yī)藥產(chǎn)品供應(yīng)鏈帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。很多科學(xué)家也在努力促進(jìn)使用合成rFC代替LAL，以保護(hù)鱟免于滅絕，加速了rFC作為藥典試驗(yàn)的采用。隨著制藥行業(yè)發(fā)展，越來(lái)越多法規(guī)許可rFC作為L(zhǎng)AL方法的替代方法（表1）。目前有超過(guò)100家生產(chǎn)公司在使用rFC方法用于質(zhì)控，以實(shí)現(xiàn)高效的過(guò)程生產(chǎn)和質(zhì)量。

 

Lonza是被授權(quán)生產(chǎn)rFC因子的廠商，其中PyroGene重組因子試劑盒已被多家藥企使用。一項(xiàng) 多中心研究顯示，使用PyroGene從水和其它測(cè)試產(chǎn)品中回收內(nèi)毒素與基于LAL的方法相當(dāng)。試劑盒驗(yàn)證的結(jié)果發(fā)表在藥典論壇36[1]卷（2010年1月-2月）。

自1970年至今半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，Lonza作為較早期開(kāi)發(fā)內(nèi)毒素檢測(cè)產(chǎn)品的公司，為客戶(hù)提供包括細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒、內(nèi)毒素檢測(cè)軟件、內(nèi)毒素檢測(cè)酶標(biāo)儀在內(nèi)的一站式解決方案，符合FDA21CFR part 11和歐盟EUGMP附錄11法規(guī)要求，已用于國(guó)外藥物的放行，滿(mǎn)足出口型/雙報(bào)制藥企業(yè)的規(guī)模化內(nèi)毒素測(cè)定需求。