通用名稱：豬偽狂犬病病毒野毒株熒光定量RT-PCR試劑盒

【包裝規(guī)格】  50T/盒

【預期用途】

本試劑盒利用實時熒光PCR原理，對引起的疾病診斷及療效評估有重要指導意義。

【檢驗原理】

本試劑盒針對的高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針，在反應體系中含基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應通道信號進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結果的定性分析。

豬偽狂犬病病毒野毒株熒光定量RT-PCR試劑盒【主要組成成份】

序號 組成 25T/盒 50T/盒

1 RT-PCR反應液 375 μL×1管 750 μL×1管

2 逆轉(zhuǎn)錄酶 50 μL×1管 100 μL×1管

3 Taq酶 75 μL×1管 150 μL×1管

4 陽性對照 40 μL×1管 40 μL×1管

5 陰性對照 40 μL×1管 40 μL×1管

6 說明書 1份 1份

注：陰性對照為偶蹄獸類基因組DNA，陽性對照為失去活性的cDNA。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1. 適用標本類型：發(fā)病動物血液、空腸及小腸腸內(nèi)容物及組織臟器(腸道組織、腸系膜及淋巴結等)和病毒培養(yǎng)液。

2. 標本采集，方法如下：

(1) 血清：用一次性注射器取靜脈血2-3ml，轉(zhuǎn)至5ml 的干燥管中，密閉送檢。

(2) 腸內(nèi)容物：無菌條件下取腸道內(nèi)容物約1g 左右，置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理鹽水)的5ml 離心管中，立即送檢。

(3) 組織臟器：取發(fā)病動物腸道組織及腸系膜淋巴結等組織約1g，置一1.5ml的潔凈離心管中，密閉送檢。

3.應避免標本間交叉污染。

4.標本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應凍存于-80℃以下，避免反復凍融。

【檢驗方法】

1.試劑準備（試劑準備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

（2）核算當次實驗所需要的反應數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數(shù)

單反液配制表(每份) RT-PCR反應液 15.0 μL

逆轉(zhuǎn)錄酶 2.0 μL

Taq酶 3.0 μL

 (3)在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。

2.樣本準備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4. PCR（PCR擴增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數(shù)進行PCR擴增。

豬偽狂犬病病毒野毒株熒光定量RT-PCR試劑盒

反應體積 25 μL 通道選擇 FAM通道采集熒光信號

PCR

反應

條件 步驟 條件 循環(huán)數(shù)

反轉(zhuǎn)錄     42℃：10分鐘（min） 1

預變性 95℃：3分鐘（min） 1

預擴增 95℃：5秒（s） 5

55℃：40秒（s）

PCR擴增 95℃：5秒（s） 40

55℃：40秒（s）

（此階段結束時采集熒光信號）

注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

 （1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。

 （2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。

2.標本結果判定：

（1）陽性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

（2）可疑：標本檢測結果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。

（3）陰性：標本檢測結果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗結果的解釋】

通道及檢測結果 標本檢測結果解釋

FAM

陽性（＋） 標本中檢出RNA

陰性（－） 標本中未檢出RNA

豬偽狂犬病病毒野毒株熒光定量RT-PCR試劑盒【檢驗方法的局限性】

1.當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的低檢出*可能會發(fā)生假陰性的結果。

2.被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結果。

3.樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結果。

【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的低檢出限為102 Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤5%。

【注意事項】

1.整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作，各區(qū)實驗服、儀器、耗材應獨立使用，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進行操作；三個區(qū)應該配有紫外線殺菌裝置。

2.為避免RNA降解，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理。

3.每次實驗應該設置陰、陽性對照。

4.試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時離心。

5.試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在次使用前應全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū)，并單獨存放。

6.為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進行任何標記。

7.儀器擴增相關參數(shù)應按照本說明書相關要求進行設置；不同批號試劑不能混用。

8.ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。

9.實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應該進行無害化處理后方可丟棄。

豬偽狂犬病病毒野毒株熒光定量RT-PCR試劑盒