【技術(shù)文章】細(xì)胞養(yǎng)不好？這些注意事項請收好（三）

1、購買的細(xì)胞死亡或存活率不佳可能原因？細(xì)胞冷凍管解凍后，為何會有細(xì)胞數(shù)目太少的情形？

研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳；血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳；解凍過程錯誤；冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心；懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞；培養(yǎng)溫度使用錯誤；細(xì)胞置于 –80 ℃ 太久。

研究人員在冷凍細(xì)胞培養(yǎng)時出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細(xì)胞的物理性損傷，以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細(xì)胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

2、收到的冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落的原因？

冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，是因熱脹冷縮的物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。

3、如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？

培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在 MEM 中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長。總之，選 MEM 做粘附細(xì)胞培養(yǎng)，RPMI-1640 做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個好的開始，各種目的無血清培養(yǎng)shou選 AIM V（12005）培養(yǎng)基（SFM）。

4、L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。

5、GlutaMAX-I 是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用 GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定？

GlutaMAX-I 二肽是一個 L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的 alpha-氨基用 L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放 L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常穩(wěn)定，即使在 121 磅滅菌 20 分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎*降解。

6、什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為 PH 值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。

7、為什么目錄上說 Hank's 平衡鹽溶液 （HBS） 在空氣中使用，不需要 CO2 培養(yǎng)箱？HBS 和 Earle's 平衡鹽溶液 （EBS） 有什么本質(zhì)的功能差別？

HBS 和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，在 Eagles （2.2 g/L） 中比在 Hanks （0.35 g/L） 中高。碳酸氫鈉需用高水平的 CO2 平衡，以維持溶液的 PH 值。Eagles 液在空氣水平的 CO2 中，溶液會變堿，Hanks 液在 CO2 培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在 CO2 培養(yǎng)箱中保存組織，需要用 Eagles 液，如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用 Hanks 液就可以了。

8、二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入 EDTA 的目的是什么？

二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA 用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用 EDTA 清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。

9、其他注意事項

o 當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的 50%。血清蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細(xì)胞達到毒性水平。

o 一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

o 大部分添加物和試劑多可以凍融 3 次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。

o 在溶解的一周內(nèi)使用貯存在 4℃ 冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在 4℃ 就可能開始降解，如果在室溫下放置超過 30 分鐘，就會變得不穩(wěn)定。

o 為了保持 CO2 培養(yǎng)箱水盤清潔，需定期 （至少每兩周一次） 用無菌蒸餾水或無菌去離子水更換。