現代生物技術均通過細胞作為載體來進行，無論是基因治療、干細胞、克隆技術都在細胞內進行的。細胞的生長需要一定的營養環境，用于維持細胞生長的營養基質稱為培養基，即指所有用于各種目的的體外培養、保存細胞用的物質，就其本意上講為人工模擬體內生長的營養環境，使細胞在此環境中有生長和繁殖的能力。它是提供細胞營養和促進細胞生長增殖的物質基礎。細胞培養基其組成成分主要有：水、氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子及其他一些入核酸降解物、激素等。

隨著動物細胞大規模培養技術的迅速發展，作為細胞培養領域中zui基本的原料－細胞培養基的用量也迅速增加，被廣泛應用于細胞生物學科和醫學研究的各個領域，如疫苗生產（人用疫苗如乙腦、狂犬、甲肝、乙肝、出血熱、麻疹等，獸用疫苗如口蹄、馬立克、偽狂犬等），基因藥物生產（如EPO、TPA等），臨床用單抗（如抗人肝癌單抗、抗人肺單抗、WT3）等。

*節 水與平衡鹽溶液

1、培養用水:體外培養的細胞對水質特別敏感，對水的純度要求較高。培養用水中如果含有一些雜質，即使含量極微，有時也會影響細胞的存活和生長，甚至導致細胞死亡。用金屬蒸餾器制備的蒸餾水，可能會含有某些金屬離子，一般不作為培養用水。配制培養用液應使用經石英玻璃蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水。用瓶貯存，存放時間一般不應超過2周。

2、緩沖溶液、生理鹽水、平衡鹽溶液：稍后介紹。

第二節 細胞培養基的基本要求

體外培養的細胞直接生活在培養基中，因此培養基應能滿足細胞對營養成分、促生長因子、激素、滲透壓、pH等諸多方面的要求。

一、營養成分 維持細胞生長的營養條件一般包括以下幾個方面：

1、氨基酸：是細胞合成蛋白質的原料。所有細胞都需要12種必須氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸。此外還需要谷氨酰胺，它在細胞代謝過程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的來源，同樣也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物質。 體外培養的各種培養基內都含有必需氨基酸。

2、單糖：培養中的細胞可以進行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細胞對葡萄糖的吸收能力zui高，半乳糖zui低。

體外培養動物細胞時，幾乎所有的培養基或培養液中都以葡萄糖作為必含的能源物質。

3、維生素：主要扮演輔酶、輔基的角色，*。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養基常有的成分。

4、無機離子與微量元素：細胞生長除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。

二、促生長因子及激素 已證實：各種激素、生長因子對于維持細胞的功能、保持細胞的狀態（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素對許多細胞生長有促生長作用，如胰島素，它能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對某一類細胞有明顯促進作用，如H-化-可的松可促進表皮細胞的生長，泌乳素有促進乳腺上皮細胞生長作用等。

三、滲透壓 細胞必須生活在等滲環境中，大多數培養細胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg, 可視為培養人體細胞的理想滲透壓。鼠細胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數哺乳動物細胞，滲透壓在260－320mOsm/kg的范圍都適宜。

四、pH 氣體也是細胞生存的必需條件之一，所需氣體豐要是氧和二氧化碳。氧參與三羧酸循環，產生能量供給細胞生長、增殖和合成各種成分。一些細胞在缺氧情況下，借糖酵解也可獲取能量，但多數細胞缺氧不能生存。在開放培養時，一般置細胞于95％空氣加5％二氧化碳的混合氣體環境中培養。二氧化碳既是細胞代謝產物，也是細胞所需成分，它主要與維持培養基的pH有直接關系。動物細胞大多數需要輕微的堿性條件，pH值約在7．2~7．4℃在細胞生長過程中，隨細胞數量的增多和代謝活動的加強，二氧化碳不斷被釋放，培養液變酸，PH值發生變化。由于NaHCO3容易分解為二氧化碳，很不穩定，致使緩沖系統難以地控制。故這一緩沖系統適合密閉培養。HEPES結合碳酸氫鈉使用，可提供更有效的緩沖體系，主要是防止pH值迅速變動，但zui大缺點是在開放培養或觀察時難以維持正常的pH值。造成pH波動主要是代謝產生的CO2，在封閉式培養過程中CO2與水結合產生碳酸，培養基pH很快下降。為解決這一問題，合成培養基中使用了NaHCO3-CO2緩沖系統，并采用開放培養，使細胞代謝產生的CO2及時溢出培養瓶，再通過穩定調節溫箱中CO2濃度（5％），與培養基中的NaHCO3處于平衡狀態。

五、無毒、無污染 體外生長的細胞對微生物及一些有害有毒物質沒有抵抗能力，因此培養基應達到無化學物質污染、無微生物污染（如細菌、真菌、支原體、病毒等）、無其他對細胞產生損傷作用的生物活性物質污染（如抗體、補體）。對于天然培養基，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應當嚴格選材，嚴格操作。對于合成培養基，污染主要來源于配制過程，配制所用的水，器皿應十分潔凈，配制后應嚴格過濾除菌。 

第三節 天然細胞培養基

天然培養基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養技術建立早期，體外培養細胞都是利用天然培養基。但是由于天然培養基制作過程復雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養基所替代。目前廣泛使用的天然培養基是血清，另外各種組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質在培養某些特殊細胞也是*。

一、血清(serum)細胞培養的發展，培養基的質量又是關鍵，而培養基的主要成份中動物血清對細胞的生長繁殖發揮著重要甚至是難以替代的作用。在動物血清的應用中牛血清又是的，所以血清是醫藥生物技術產品中重要的原材料之一。保證血清質量也是促進生物制品質量提高的重要環節。

1、血清種類:目前用于組織培養的血清主要是牛血清，培養某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養細胞的原因：來源充足、制備技術成熟、經過長時間的應用考驗人們對其有比較深入的理解。牛血清對絕大多數哺乳動物細胞都是適合的，但并不排除在培養某種細胞時使用其他動物血清更合適。

牛血清是細胞培養中用量zui大的天然培養基，含有豐富的細胞生長必須的營養成份，具有極為重要的功能。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應取自剖腹產的胎牛；新牛血清取自出生24小時之內的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。顯然，胎牛血清是品質zui高的，因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分zui少。

2、血清的主要成分:血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等，這些物質對促進細胞生長或抑制生長活性是達到生理平衡的。對血清的成分和作用的研究雖有很大進展，但仍存在一些問題。主要是：

*:血清的成份可能有幾百種之多，目前對其準確的成份、含量及其作用機制仍不清楚，尤其是對其中一些多肽類生長因子、激素和脂類等尚未充分認識，這給研究工作帶來許多困難；

第二:血清都是批量生產，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實驗的標準化和連續性受到限制；

第三:不能排除血清中含有易變物質，這被認為是“瓶中惡化”的原因之一。

3、血清主要作用：

提供基本營養物質：氨基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物等，是細胞生長必須的物質。

提供激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺皮質激素（H-化-可-的松、地塞米松）、類固醇激素（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。

提供結合蛋白：結合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉鐵蛋白攜帶鐵。結合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。

提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。

對培養中的細胞起到某些保護作用：有一些細胞，如內皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發現的，現在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。因為胰蛋白酶已經被廣泛用于貼壁細胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護細胞免受機械損傷，特別是在懸浮培養攪拌時，粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。

4、細胞培養中使用血清的缺點

血清成分復雜，雖含許多對細胞有利成分，也含有對細胞有害的成分，使血清有幾個明顯的缺點：

對大多數細胞，在體內狀態，血清不是它們接觸的生理學液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細胞在體內的正常狀態，血清可能促進某些細胞的生長（成纖維細胞）同時抑制另一類細胞生長（表皮細胞）。

血清含一些對細胞產生毒性的物質，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細胞的多胺反應（如精胺、亞精胺）形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長，甚至造成細胞死亡。

動物個體不同，血清產地、批號不同，每批質量差異甚大，其成分不能保持一致。

取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產生潛在影響，可能導致實驗失敗或實驗結果不可靠性。

血清的使用使得實驗和生產的標準化困難，其中的蛋白質使得某些轉基因蛋白生物藥品生產中分離純化工作很難完成。

大規模生產中，血清來源越來越困難，價格昂貴，是構成動物細胞培養對生產成本的主要部分之一。 

5、血清的質量標準:血清質量高低取決于兩方面因素：一是取材對象，二是取材過程。用于取材的動物應健康無病并且在的出生天數之內，取材過程應嚴格按照操作規程執行，制備出的血清要經過嚴格的質量鑒定。WHO公布的《用動物細胞體外培養生產生物制品規程》中的要求：

牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應具備適當的監測系統。

有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。

證明所用牛血清中不含對所生產疫苗病毒的抑制物。

血清要通過濾膜過濾除菌，保證無菌。

無細菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家要求無細菌噬菌體污染。

對細胞有良好的支持繁殖作用。

我國在對牛血清的質量2000年版《中國生物制品主要原輔料質控標準》中提出比較嚴格的標準要求。包括蛋白質含量，細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內毒素，支持細胞增殖檢查。

血清質量的鑒定一般包括以下幾個方面：

理化性質：如滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內毒素等。蛋白含量包括血清總蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（應小于20g/L)、血紅蛋白含量等。其中球蛋白含量是一項非常重要的指標，血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清質量越高。血紅蛋白也是越低越好。

微生物檢測：包括細菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對支原體、病毒的檢測，支原體是一種很小的微生物，可通過孔徑22u的濾膜。支原體、病毒污染在光學顯微鏡下難于察覺，細胞也能生長繁殖，但會影響實驗結果。檢測支原體的方法很多，如培養法、PCR法、熒光染色法、電鏡觀察法等。

促生長效果：這是血清重要的特性之一，應當以培養的細胞來檢測。有兩種方法：克隆形成率、貼瓶率測定法和連續傳代培養法。

(1)克隆形成率測定:一般以懸浮生長的細胞為培養對象，按有限稀釋法做克隆化培養，將不同批號的血清配制成不同濃度的培養基，細胞也稀釋成不同濃度，接種到96孔板，每孔200ul，培養一定時間，統計有克隆生長的孔，計算出百分比，再與對照的標準血清相比較，就可看出不同批號血清間的區別。比較低的濃度，更能觀察出血清質量間的細微差別。

(2)貼瓶率測定:是以貼壁細胞為培養對象，將細胞稀釋至低密度，接種至平皿，每皿200或100個細胞，以不同濃度的血清培養基培養，培養一定時間后棄培養基，染色后統計集落數，計算出集落數占接種細胞數的百分比，同樣再與標準血清比較，判斷血清質量高低。

(3)連續傳代培養法:是將細胞培養于3個一定體積的培養瓶中，待測血清配制為5％濃度，一般于第七天收集細胞，計數，取平均值，中間可以更換一次培養基。連續測試三個周期以上，觀察細胞生長狀況，并將每次的計數結果與標準血清的測試結果比較。

對于使用者，判斷血清質量先從外觀入手。好的血清應該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少沉淀，比較粘稠。如發現血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說明血清污染或血清中的蛋白質變性；若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時有溶血現象；如果搖晃時感覺液體稀薄，說明血清中摻入的生理鹽水太多。如果要進一步了解血清的質量，則應連續培養某些細胞，觀察細胞生長狀況。

6、血清的使用與儲存:正確的使用及保存血清，才能使血清發揮應有的作用。

使用前處理：大部分血清在使用前必須滅活處理，即56℃30分鐘。滅活的目的是去除血清中的補體成分，避免補體對細胞產生毒性作用。血清經過滅活也會損失一些對細胞有利的成分，如生長因子，因此也有人提出血清不經滅活直接用于培養，這樣做的前提是確認血清中不含補體成分。對于一些品質高的胎牛血清和新牛血清可以考慮不經滅活直接用于細胞培養。

儲存條件：血清一般儲存于－20℃，同時應避免反復凍融。購買大包裝的血清后，首先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲存于－20℃，使用前融化。融化時現置于4℃。融化后的血清在4℃不宜長時間存放，應盡快使用。

使用濃度：自從有了合成培養基，血清就是作為一種添加成分與合成培養基混合使用，使用濃度一般為5－20％，zui常用是10％。過多血清容易使培養中的細胞發生變化，特別是一些二倍體的無限細胞系，迅速生長之后容易發生惡性轉化。 采購血清時，先從供應商處索取樣品進行試驗，選定一批后就要保留足夠使用6個月至1年的量，直至用另一批經過預先試驗的樣品代替。

二、胚胎浸出液

胚胎浸出液(embryonic extract)是早期動物細胞培養中應用的天然培養基，現已很少使用。

三、水解乳蛋白 水解乳蛋白(lactalbumin hydrolysate)為乳白蛋白經蛋白酶和肽酶水解的產物，含有豐富的氨基酸，是常用的天然培養基，可用于許多細胞和原代細胞的培養。