PCR儀基因擴(kuò)增儀的選擇技巧
PCR原理
DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶的作用下，以單鏈為模版，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成新的單鏈，與模版配對成為雙鏈分子挎貝。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)與模板DNA的5’端結(jié)合的兩條引物，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制，多次重復(fù)“變性解鏈—退火—合成延伸”的循環(huán)就可以以幾何級數(shù)大量擴(kuò)增特定的基因。

發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該類酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。

從PCR原理可以看出，PCR儀的關(guān)鍵是升降溫的步驟。現(xiàn)在偶爾還能聽到一些前輩們笑談早年的PCR實(shí)驗(yàn)如何在3個(gè)水浴鍋中完成的趣聞。經(jīng)過不斷改進(jìn)，今天的PCR已經(jīng)越來越完善和智能化。出于市場推廣的戰(zhàn)略需要，各廠家的PCR儀型號不同，著力宣傳的技術(shù)指標(biāo)和參數(shù)也不盡統(tǒng)一，生物通的編者在這里簡單列出選購時(shí)我們認(rèn)為應(yīng)該考慮的常用指標(biāo)，希望有助于大家選購PCR儀的選購技巧。

PCR儀介紹及其選購
PCR儀的種類總體來說可以分為兩大類：PCR擴(kuò)增儀和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，普通的PCR擴(kuò)增儀又衍生出帶梯度PCR功能的梯度PCR儀、和帶原位擴(kuò)增功能的原位PCR儀等等。1996年由ABI公司首先推出將擴(kuò)增和檢測融為一體的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，
一、溫度控制
對普通PCR儀來說，溫度控制指標(biāo)主要是指溫度的準(zhǔn)確性、均勻性、以及升降溫速度，對梯度PCR儀來說，除了溫度的準(zhǔn)確性和均勻性、升降溫速度以外，還必須考慮儀器在梯度模式和標(biāo)準(zhǔn)模式下是否具有同樣的溫度特性。

溫度的準(zhǔn)確性是指樣品孔溫度與設(shè)定溫度的一致性，它直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。如果排除樣品加入過程中的問題，對于PCR反應(yīng)而言zui重要的莫過于溫度控制的準(zhǔn)確性，由于PCR是一個(gè)幾何級數(shù)擴(kuò)增的過程，擴(kuò)增過程中退火溫度的細(xì)微變化會被放大而直接影響結(jié)果，不論是變性、退火還是延伸都需要準(zhǔn)確控制溫度，對退火溫度而言溫控顯的尤為重要，有時(shí)1度甚至0.5度的差異也能決定實(shí)驗(yàn)的成功與失敗，所謂差之毫厘，謬之千里。因而對PCR擴(kuò)增儀而言溫度控制就意味著質(zhì)量。

溫度的均勻性是指樣品孔間的溫度差異，它關(guān)系到在不同樣品孔進(jìn)行反應(yīng)結(jié)果的一致性。我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有時(shí)用同樣的樣品，同樣的PCR反應(yīng)程序，zui后的結(jié)果竟然差異非常明顯，或許就是因?yàn)椴煌恢玫臏囟炔痪恍运隆Ｒ恍┦褂眠^早期PCR儀的腦子格外靈光的研究人員偏愛使用PCR儀中間某幾個(gè)固定的孔，就是因?yàn)檫^往反復(fù)的教訓(xùn)和認(rèn)真的思索得出了這樣的結(jié)論，PCR儀的溫度均勻性不好，特別是zui外周的樣品孔情況更差，很有可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果——即“位置的邊緣效應(yīng)”會影響結(jié)果的可重復(fù)性。正是這種位置效應(yīng)對定量PCR的結(jié)果的影響更為明顯，所以后來才有Roche和Cobbett的離心式定量PCR的重大創(chuàng)新。

溫度控制除了度，還有一個(gè)廠家喜歡大力宣傳的指標(biāo)——升降溫的速度。更快的升降溫速度，可以縮短反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間，而且縮短了可能的非特異性結(jié)合、反應(yīng)的時(shí)間，能提高PCR反應(yīng)煌特異性。因此從本質(zhì)而言溫控方式就從以前相對穩(wěn)定耐用的機(jī)械式轉(zhuǎn)向了升降溫更快速的半導(dǎo)體。除了機(jī)械本身的原因，影響升降溫速度的還有制作承托樣品管的基座模塊的材料的導(dǎo)熱性。

作為用戶來說，當(dāng)然更愿意選擇升降溫速度快的，這就像汽車上好看的表面配置一樣容易看到，而內(nèi)在的穩(wěn)定性和耐用性往往是看不到的而容易被忽略。必須注意到，儀器的升降溫速度和樣品管中的樣品的升降溫速度并非同一回事，因?yàn)闃悠饭芘c基座接觸的緊密性、導(dǎo)熱性、鄰近樣品管的相互影響都會影響樣品的實(shí)際升降溫速度。

現(xiàn)在的PCR儀一般具有兩種溫控模式，即模塊溫控模式（Block-control）和反應(yīng)管溫控模式）（tube-control）。在模塊溫控模式下，機(jī)器根據(jù)探se器直接探se的溫控模塊（即承載樣品的金屬臺）的溫度進(jìn)行控制，這種模式適用于長時(shí)間的靜態(tài)孵育（如連接、酶切、去磷酸化等）。反應(yīng)管溫控模式實(shí)際上是一種模擬試管/PCR板的溫控模式，根據(jù)探se器所探測到的溫控模塊的溫度由計(jì)算機(jī)計(jì)算出管內(nèi)/PCR板孔內(nèi)樣品液的溫度來進(jìn)行控制。一般說來，試管溫控更為準(zhǔn)確，因?yàn)楣軆?nèi)樣品的溫度無法與溫控模塊同時(shí)達(dá)到預(yù)設(shè)溫度。特別是PCR反應(yīng)中的孵育過程一般都很短暫（30秒或更短），如果采用只有模塊溫控模式的話，反應(yīng)混合物孵育的時(shí)間與程序設(shè)定的時(shí)間會有相當(dāng)大的差距。而反應(yīng)管控制的算法能自動(dòng)補(bǔ)償時(shí)間，而且適合各種類型的反應(yīng)管，確保反應(yīng)混俁物按照程序設(shè)定的時(shí)間維持預(yù)設(shè)溫度。

有的PCR儀廠家推出了另一種溫控方式；熱敏電極溫控模式。該方法將一個(gè)熱敏電極插入一個(gè)專門的測量管中（管中裝有礦物油），反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，將該測量管插入溫控模塊的樣品進(jìn)行檢測。他們認(rèn)為通過此途徑可以監(jiān)測反應(yīng)管內(nèi)樣品的實(shí)際溫度，但這種方法未免有些華而不實(shí)；（1）測量管中礦物油的溫度變化與實(shí)際反應(yīng)樣品的溫度變化未必一致；（2）因?yàn)闇y量管必須占用一個(gè)樣品孔，所以使用該溫控方式時(shí)就無法使用96孔PCR板作實(shí)驗(yàn)。

梯度PCR

對于一個(gè)PCR反應(yīng)，雖然有各種各樣的PCR引物設(shè)計(jì)軟件或者經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算zui適的退火溫度，可是由于模版中堿基的組合千變?nèi)f化，對于特殊片斷，經(jīng)驗(yàn)公式得到的數(shù)據(jù)不一定能"P"出來結(jié)果，細(xì)微的變化對結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問題——在反應(yīng)過程中每個(gè)孔的溫度控制條件可以在范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出的反應(yīng)條件。不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化——對于多種聚合酶混合酶擴(kuò)增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數(shù)高保真Taq酶來說這個(gè)非常重要，因?yàn)門aq和校正酶的*反應(yīng)溫度可能有顯著差異，優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。多次實(shí)驗(yàn)可在一臺儀器上完成，既節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間提率，又節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。

對于帶梯度功能的PCR儀，需要考慮梯度模式下不同梯度管排間的溫度均勻性和準(zhǔn)確性，還必須考慮儀器在梯度模式和標(biāo)準(zhǔn)模式下是否具有同樣的溫度特性。這種差異可能導(dǎo)致在梯度模式下得出的*條件與標(biāo)準(zhǔn)模式下單獨(dú)做的結(jié)果出現(xiàn)差異。SteadySlope技術(shù)是eppendorf擁有的梯度PCR技術(shù)，可以同樣的溫度變化速率到達(dá)所有設(shè)定的梯度溫度，所以在梯度模式下具有恒定的溫度性。這一技術(shù)保證了在梯度模式和普通模式之間可以進(jìn)行可靠的信息傳遞，不會因?yàn)闇囟忍匦圆煌鴮?dǎo)致產(chǎn)量和特異性的變化。MJ公司沒有付費(fèi)而選擇在梯度模式下采用不同的降溫速率，每個(gè)梯度溫度之間的溫度曲線不同，從梯度模式向普通模式進(jìn)行轉(zhuǎn)換的可能會出現(xiàn)問題。此外采用TCT（三組回路）技術(shù)的梯度PCR儀由于在梯度PCR模式下增加了一個(gè)加熱和冷卻的控制區(qū)域，保證了梯度溫度控制的性并使不同梯度管排間的溫度均勻性更好。

在PCR儀上增加原位PCR模塊就可以在玻片上進(jìn)行原位PCR擴(kuò)增，MJ和eppendorf的PCR儀都有提供原位適配器以滿足不同需要。購買配有支持原位PCR模塊的PCR儀對從事醫(yī)學(xué)研究的工作者是很值得的，一機(jī)兩用。

此外，隨著基因組高通量研究的需求的提高，各品牌都推出了多槽式高通量PCR儀，各有特長：MJ有一種一拖四，就是1個(gè)主機(jī)帶4個(gè)擴(kuò)增槽，每個(gè)槽可以獨(dú)立控溫，一次可以作96x4個(gè)樣品的PCR，不過一旦出現(xiàn)問題4個(gè)都不能用了。ABI則在原來的9700的基礎(chǔ)上推出了雙384孔的基座，一次完成384x2個(gè)樣品，使得9700的功能又?jǐn)U展到高通量領(lǐng)域而無需購買新的機(jī)器，可惜兩個(gè)384槽不能獨(dú)立控溫。eppendorf則有一個(gè)控制面板，可以控制5個(gè)獨(dú)立的PCR儀，每臺機(jī)器可以聯(lián)合，而且互不影響，但是比較浪費(fèi)空間。

二、儀器的功能性和人性化設(shè)計(jì)
當(dāng)然是越簡單方便的設(shè)計(jì)zui符合用戶的要求。

熱蓋——現(xiàn)在的PCR儀一般均配備熱蓋，熱蓋溫度設(shè)為105℃，使樣品管頂部的溫度達(dá)到105℃左右，蒸發(fā)的反應(yīng)液就不會產(chǎn)生凝集在管蓋上而改變反應(yīng)體積，這樣用戶就無需再向反應(yīng)管內(nèi)加石蠟油，直接減少后繼反應(yīng)的麻煩。如果是旋轉(zhuǎn)加壓的熱蓋就要特別小心，因?yàn)閴毫Φ竭_(dá)時(shí)沒有明顯的提示，用戶需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)將熱蓋旋到合適位置，不太容易掌握。如果過松，熱蓋沒有充分接觸反應(yīng)管而影響結(jié)果；如果過緊，則會導(dǎo)致反應(yīng)管變形，甚至可能造成熱蓋的機(jī)械故障。的ESP技術(shù)是指熱蓋加熱時(shí)不接觸樣品管，避免加熱樣品管導(dǎo)致非特異產(chǎn)物，等加熱到設(shè)定溫度后熱蓋下降，將樣品管壓入加熱模塊，下降時(shí)間和壓力都由電子控制。

樣品基座——PCR反應(yīng)多在0.2或者0.5的管子中進(jìn)行，多數(shù)PCR儀也配備了不同的可更換樣品槽適配不同的樣品管。eppendorf有一個(gè)有趣的設(shè)計(jì)，一個(gè)槽內(nèi)帶有0.2和0.5兩種不同樣品孔，不需更換基座就可以分別使用兩種不同的反應(yīng)管，或者96孔板，加原位適配器就可以變成原位PCR了。避免了換基座的麻煩。當(dāng)然不同的反應(yīng)管不可以同時(shí)使用的，因?yàn)楦叨炔煌瑹嵘w不能作用。ABI的9700就可以更換不同的樣品槽，樣品槽系列擴(kuò)增到從0.5到標(biāo)準(zhǔn)96孔，到雙384孔板，分別適合不同的需要，相當(dāng)靈活。

軟件——新的PCR儀都比較注重程序編寫的簡易性。大屏幕，顯示實(shí)時(shí)信息，，記憶存儲多個(gè)程序、自動(dòng)斷電保護(hù)等都有助于實(shí)驗(yàn)室中的復(fù)雜環(huán)境使用。程序儲存方面，有人覺得儲存程序的多少似乎意義不太大，但是對于實(shí)驗(yàn)人員多、PCR儀每天運(yùn)作頻繁的實(shí)驗(yàn)室來說，每個(gè)使用者獨(dú)立儲存自定義的PCR程序，確實(shí)能方便下一次的調(diào)用，會節(jié)約一些時(shí)間。

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