重現(xiàn)性差代表液相色譜故障了？

    重現(xiàn)性差是液相色譜分析中出現(xiàn)故障的一個(gè)準(zhǔn)確信號，首先在分析那些滿足系統(tǒng)適配性的樣品時(shí)出現(xiàn)的問題，分析工作者使用這些樣品測定時(shí)，液相色譜方法及其系統(tǒng)能否很好的工作？其次，測得的峰面積值變化范圍與通常觀察到的測量誤差比較起來是否相差很大？

    重現(xiàn)性差是液相色譜分析中出現(xiàn)故障的一個(gè)準(zhǔn)確信號，首先在分析那些滿足系統(tǒng)適配性的樣品時(shí)出現(xiàn)的問題，分析工作者使用這些樣品測定時(shí)，液相色譜方法及其系統(tǒng)能否很好的工作？其次，測得的峰面積值變化范圍與通常觀察到的測量誤差比較起來是否相差很大？

zui后，當(dāng)空白樣品基體與已知樣品進(jìn)行比較表現(xiàn)出不同時(shí)如何判別？都是需要解決的問題！

           系統(tǒng)適配性分析試驗(yàn)中的奇怪的譜圖

 問題

用我的方法進(jìn)行系統(tǒng)適配性樣品性能試驗(yàn)時(shí)遇到了費(fèi)解的問題。 我分析測定了儲(chǔ)存于不同強(qiáng)制條件下樣品的穩(wěn)定性。我將所有的標(biāo)準(zhǔn)品都制成同一溶液并立即冷凍在--78℃溫度下 。每隔一段時(shí)間取出 3小瓶做系統(tǒng)適配性分析試驗(yàn)，取另一小瓶作為校準(zhǔn)標(biāo)樣.每一小瓶中都配有一個(gè)分析物和一個(gè)內(nèi)標(biāo)物。

系統(tǒng)適配性試驗(yàn)需要從每個(gè)系統(tǒng)適配性標(biāo)樣小瓶中取出一份，進(jìn)行3次進(jìn)樣。該法要求保留時(shí)間的重現(xiàn)性以及分析物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值（ 響應(yīng)因子）的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在一定的范圍之內(nèi)。

我用該法在zui后兩次測定時(shí)發(fā)現(xiàn)了奇怪的色譜圖形。 在所有情況下， 前兩個(gè)小瓶進(jìn)樣的響應(yīng)值相同，但第3個(gè)小瓶進(jìn)樣的峰面積明顯變小。在每個(gè)小瓶中， 峰面積是恒定的， 所有進(jìn)樣的保留時(shí)間是相同的，而且響應(yīng)因子的 RSD是良好的 。這個(gè)分析是滿足系統(tǒng)適配性要求的， 后來對強(qiáng)制樣品的分析也都得出所期待的結(jié)果。 *奇怪的問題是，系統(tǒng)適配性

進(jìn)樣的第 3 個(gè)小瓶的峰面積響應(yīng)出現(xiàn)階躍變化，這是怎樣產(chǎn)生的？

 解答

峰面積之所以下降，是由兩個(gè)原因之一引起的——或者進(jìn)樣體積減小，或者樣品濃度變低。 可利用內(nèi)標(biāo)來補(bǔ)償進(jìn)樣體積的變化或預(yù)處理時(shí)的樣品損失。內(nèi)標(biāo)正確地補(bǔ)償了這些變化，得出的結(jié)果就能令人滿意。

首先，讓我們再做幾次試驗(yàn)以考察與標(biāo)樣有關(guān)的潛在問題，例如， 究竟是3號小瓶的內(nèi)容物有問題， 還是它所處的位置或進(jìn)樣順序有問題。若仍有標(biāo)樣，應(yīng)按第1次3個(gè)小瓶的順序重新進(jìn)樣，并觀察是否出現(xiàn)相同的現(xiàn)象。 然后重新安排這 3個(gè)小瓶的進(jìn)樣順序（ 例如改成 2號、 3號、1號的順序），觀察究竟是小瓶內(nèi)容物還是進(jìn)樣順序引起了峰響應(yīng)的改變。

若因稀釋錯(cuò)誤使 3 號小瓶內(nèi)所裝的分析物和內(nèi)標(biāo)物濃度變低， 則峰面積應(yīng)該下降，但響應(yīng)因子應(yīng)該相同。 濃度低的可能性很小， 因?yàn)樗行∑恐械臉悠范际窃谕粫r(shí)間制備并儲(chǔ)存在相同條件下的。重新檢查這些系統(tǒng)適配性標(biāo)樣的制備過程，可能會(huì)揭示出問題的根源。

若低響應(yīng)是由小瓶的位置而不是由于裝瓶時(shí)樣品濃度不同所致，則問題的出現(xiàn)可能是由自動(dòng)進(jìn)樣器或色譜柱的填充狀況變化造成的。這種可能性可以通過第 3次進(jìn)樣后將前兩個(gè)小瓶中的樣品重新進(jìn)樣來檢查。若響應(yīng)仍然很低，應(yīng)該考慮邏輯線路方面的問題。若響應(yīng)回到正常值，就將第3個(gè)小瓶樣品再重新進(jìn)樣一次。

根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，系統(tǒng)填充情況的變化不是像你觀察到的階躍變化， 而是一個(gè)漸變的過程。 例如，由于在柱內(nèi)硅醇基與堿性官能團(tuán)之間的相互作用使分析物的峰產(chǎn)生嚴(yán)重拖尾。有時(shí)在正常濃度或高濃度情況下 ，進(jìn)幾次標(biāo)樣能使硅醇基失活， 并可改善下幾次進(jìn)樣的峰形 。同樣，若系統(tǒng)中某一部位還在吸附樣品，就必須在獲得正常響應(yīng)之前進(jìn)幾次樣 ? 使活性部

位飽和。無論如何，在這種情況下，流出圖上的峰面積是逐漸增大而不是逐步減小的，因此我并不認(rèn)為這種解釋是適合于現(xiàn)有問題的。

我猜想自動(dòng)進(jìn)樣器的第 3個(gè)位置可能出了毛病。如果發(fā)生了這種情況，以后的工作就應(yīng)該避開那個(gè)位置。同時(shí)也要仔細(xì)檢查控制程序， 以確保對第 3個(gè)小瓶的較少進(jìn)樣不給出指令。這兩個(gè)問題也可以通過使用其它方法用另一個(gè)標(biāo)樣來檢查，例如，在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用色譜柱試驗(yàn)樣品進(jìn)行測試，就能排除任何與方法有關(guān)的化學(xué)問題，而把問題集中在機(jī)械或電子學(xué)方面。

在這里，沒有給出任何明確的答案。通過仔細(xì)研究，尋找峰面積響應(yīng)趨勢的數(shù)據(jù)，尤其是分析物和內(nèi)標(biāo)物的數(shù)據(jù)， 就有可能發(fā)現(xiàn)問題。

峰面積的重現(xiàn)性很差

問題

用我的方法給出的峰面積的重現(xiàn)性很差。 保留時(shí)間很好，但峰面積的 RSD 已達(dá) 5%~10%，可我常見到的只有 1%~2%。 我在這個(gè)與出現(xiàn)問題有關(guān)的系統(tǒng)中什么都沒有改動(dòng)。這個(gè)系統(tǒng)由一個(gè)低壓混合系統(tǒng) 、一個(gè)自動(dòng)進(jìn)樣器、一個(gè)C8色譜柱和一個(gè)UV 檢測器組成。等度洗脫的流動(dòng)相在線混合，流動(dòng)相為PH3 的磷酸緩沖液和甲醇。

解答

峰面積的重現(xiàn)性依賴于自動(dòng)進(jìn)樣器操作的一致性。所以我認(rèn)為這就是你的問題的根源。首先，應(yīng)盡量保持進(jìn)樣的始終如一。 通過進(jìn)已知標(biāo)樣的相同樣品zui容易查出主要原因，問題可能就出在樣品瓶上。

樣品必須是均勻的。高鹽濃度的樣品基體容易分層，冷凍時(shí)會(huì)混合不勻 。萬一有分層存在， 就要來回?fù)u動(dòng)樣品瓶? 使瓶中內(nèi)容物混合均勻。樣品瓶太滿、 密封太緊可以產(chǎn)生不同的結(jié)果。

吸樣時(shí)， 樣品瓶中形成一定真空，造成吸樣困難。這種條件就造成了進(jìn)樣量的差異。通常瓶中內(nèi)容物不超過總?cè)莘e的 1/2~3/4為*。

如果樣品溶劑容易揮發(fā)， 那么樣品瓶密封不良也能出現(xiàn)問題。 樣品溶劑的蒸發(fā)損失可以導(dǎo)致每次進(jìn)樣的樣品濃度不同。

滯留在自動(dòng)進(jìn)樣器針頭里的樣品瓶隔膜小片移動(dòng)時(shí)， 能起到開合的擋板作用 。這種情況可產(chǎn)生不良的重現(xiàn)性， 或者地說， *不能進(jìn)樣。 懷疑阻塞時(shí)可以沖洗進(jìn)樣管和進(jìn)樣針頭， 用針頭捅絲清除異物，或者更換新針頭。 使用不能被針頭穿切出小片的硅橡膠樣品瓶隔膜。 貼面的隔膜似乎比別的材料更不容易被穿切出小片。

不適當(dāng)?shù)厥褂米⑸淦骱腿友b置更容易出現(xiàn)重現(xiàn)性問題 。 例如，在我的實(shí)驗(yàn)室中把一些自動(dòng)進(jìn)樣器設(shè)計(jì)成通過很長細(xì)內(nèi)徑的塑料管把樣品從樣品瓶轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣閥中，如果這個(gè)輸送管中有氣泡， 它們遇到阻力變化時(shí)會(huì)膨脹或收縮， 導(dǎo)致從樣品瓶中吸取樣品量的變化。 為了防止這一情況發(fā)生， 分析工作者在使用前應(yīng)將溶劑*脫氣并清洗進(jìn)樣管。有些自動(dòng)進(jìn)樣器的設(shè)計(jì)是根據(jù)所要求的進(jìn)樣體積而使用不同規(guī)格的注射器 。

若注射器與樣品量失配， 動(dòng)作位置的失誤會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的誤差， 因此要注意檢查安裝的注射器是否適當(dāng)。若設(shè)計(jì)的自動(dòng)進(jìn)樣器是從樣品瓶吸取樣品再傳送到進(jìn)樣閥， 則問題可能出在進(jìn)樣閥上。 樣品針頭在進(jìn)樣口處必須密封良好， 否則樣品會(huì)泄露損失。 應(yīng)該調(diào)整或更換進(jìn)樣針頭的密封圈以防泄漏 。

流路上的任何阻力都能產(chǎn)生反壓， 造成進(jìn)樣針頭周圍泄漏。 應(yīng)檢查進(jìn)樣閥的每條通路， 尤其要保證廢液導(dǎo)管暢通。否則， 樣品溶液和緩沖液的蒸發(fā)會(huì)留下殘?jiān)?nbsp;逐漸堵塞廢液導(dǎo)管。對進(jìn)樣閥組裝不正也能產(chǎn)生反壓， 使樣品針頭的密封圈泄漏。進(jìn)樣方式能影響峰面積的重現(xiàn)性，但自動(dòng)進(jìn)樣要好于手動(dòng)進(jìn)樣。 由于流體流動(dòng)的特性，在定量管全充滿情況下，當(dāng)樣品量至少為定量管體積的二三倍時(shí)，會(huì)產(chǎn)生精度的zui高等級；而在定量管半充滿情況下， 當(dāng)樣品量少于定量管體積的一半時(shí)， 精度zui高。 由于這個(gè)原因，你應(yīng)該從兩個(gè)方面來檢查， 即不僅要檢查是否把合適的定量管安裝在自動(dòng)進(jìn)樣器上， 而且還要檢查進(jìn)樣體積是否與所要求的精度等級相一致。

泄露也能影響峰面積精度，但泄露產(chǎn)生的問題與保留時(shí)間變小相似，因此這個(gè)情況不大可能成為你的問題的根源。這樣，你可以領(lǐng)悟到進(jìn)樣精度問題有很多可能的原因。 我一開始就想仔細(xì)考察所有系統(tǒng)的設(shè)置，以保證你不出現(xiàn)誤差，然后全面考慮上面列舉的全部可能性， 看它們當(dāng)中是否有一個(gè)是問題的主要原因。

一次只改變一種可能性， 你就會(huì)找出問題的真正根源 。這個(gè)方法能幫助你懂得今后怎樣避免出現(xiàn)相同的問題。

進(jìn)一個(gè)基體空白樣品時(shí)會(huì)遇到的高壓問題

問題

有時(shí)， 用我建立的一個(gè)液相色譜方法進(jìn)一個(gè)基體空白樣品時(shí)會(huì)遇到很高的壓力 ，甚至自動(dòng)停泵。 問題出在自動(dòng)進(jìn)樣器上，因?yàn)槿绻断逻M(jìn)樣器出口管的連接接頭， 壓力是高的； 但斷開從泵到進(jìn)樣器的給料管時(shí)，壓力則正常。 通常，壓力在幾分鐘內(nèi)就能降至正常。 流動(dòng)相是乙腈和 pH7的緩沖液 。 樣品是高鹽基體中的生物分子,樣品在其制備期間被脫鹽 。 是基體空白樣中的鹽引起這個(gè)問題嗎 ?

解答

你觀察到的壓力增大很可能是由系統(tǒng)中鹽的沉淀引起的。 應(yīng)該知道鹽的濃度和流動(dòng)相的確切組成。當(dāng)乙腈同鹽和緩沖液混合時(shí)，溶解度很差是大家熟知的，例如，實(shí)驗(yàn)室分析工作者發(fā)現(xiàn)，水相含有25mmol/L  以上磷酸鹽時(shí), 乙腈濃度約大于80%就無法操作梯度系統(tǒng)了。有時(shí)，緩沖液與乙腈在主體溶液中混合不出現(xiàn)問題 ,但在線混合卻有了溶解度問題，因?yàn)槌霈F(xiàn)在混合界面的沉淀會(huì)使管道或?yàn)V片堵塞。

為了解決這個(gè)問題，采用兩種方法之一；或者在進(jìn)樣前稀釋樣品基體 ，或者通過相同的步驟凈化樣品 。 若一定要進(jìn)等量的樣品基體， 就要把稀釋倍數(shù)和進(jìn)更大的樣品體積結(jié)合起來， 例如，稀釋基體4倍， 進(jìn)樣4次同量的基體。

還可以選擇甲醇作為流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑。 鹽和緩沖液在甲醇中比在乙腈中有更好的溶解度。 當(dāng)然， 甲醇也許不能為你的方法提供所需要的色譜選擇性， 因此使用這種溶劑也可能并不奏效。分析工作者應(yīng)避免使用容易使液相色譜中的樣品和緩沖液出現(xiàn)沉淀的各種條件。 電壓升高或出現(xiàn)堵塞，充其量把系統(tǒng)沖洗一下即可解決， 但若在色譜柱中出現(xiàn)了沉淀， 你就應(yīng)該更換色譜柱， 因?yàn)檫@種沉淀不大可能再被溶解除去。

小結(jié)

將所有變量保持恒定時(shí)， 用液相色譜方法對同一化合物的重復(fù)進(jìn)樣應(yīng)得出相同的結(jié)果。每次進(jìn)樣在峰面積、保留時(shí)間或其它所測參數(shù)上的偏差大于正常系統(tǒng)誤差時(shí)， 顯然是一個(gè)或多個(gè)變量控制不當(dāng)?shù)拇_切標(biāo)志。 本文系統(tǒng)地、一步一步地將問題孤立了出來并給出了合乎邏輯的校正方法。