賽默飛推出Q Orbitrap旗艦機Orbitrap Exploris™ 480已經有一段時間了，集結了LFQ, TMT10plex, TMT11plex, TMT16plex及TurboTMT, vDIA, HR-DIA, BoxCarDDA, BoxCarDIA, PRM及SureQuant等一系列定量功能，相信大家對其整體的定量性能充滿好奇。
本期我們將要帶大家走入Exploris 480的定量之路。
1.Orbitrap Exploris™ 480質譜儀——精zhun的非標記定量
FAIMS Pro可以通過多肽帶電性質的不同分離肽段，從而作為一種在線的氣態樣品分級手段來提高復雜樣品的定性和定量效率。Exploris 480搭載FAIMS Pro，數據分析采用Proteome Discoverer2.4，將FDR設置為1%，60min和120min可分別從1ug Hela全細胞酶解產物中鑒定近6300個和7300個蛋白（圖1）。
圖1. Orbitrap Exploris™ 480 搭載FAIMS Pro的鑒定結果
用全細胞酶解產物評估非標記定量的重現性亦得到很好的結果，三次重復的重現性高達97%，蛋白定量CV值低至5%（圖2）。
圖2. Orbitrap Exploris™ 480非標記定量的重現性評估
2.FAIMS Pro 接口——TurboTMT助力多重蛋白質組學研究
10標以及11標的TMT定量憑借其“高產"的優勢，一直備受歡迎。對于高于10標的TMT定量而言，相鄰報告離子基團僅存在6mDa的質量差異，至少需要采用35,000的分辨率進行準確分辨，只能在Orbitrap平臺上實現；另外，共流出肽段的干擾也會影響TMT-MS2定量準確性。因此，10標以及11標的TMT定量也一直受到掃描速度和共流出肽段干擾兩個問題的困擾。針對這兩個問題，Exploris 480上給出了完整的解決方案（圖3）。
圖3. Orbitrap Exploris™ 480的TMT定量的性能評估
Exploris 480的TurboTMT采用ΦSDM譜圖后處理算法，當使用15,000分辨率采集數據時，報告離子處的分辨率達到了50,000，從而在保證區分質量虧損級差異的報告離子前提下提升掃描速度；Exploris 480搭載FAIMS Pro，基于價態在線分級可以緩解共流出肽段干擾的問題，從而提高定量準確度。TMT11標酵母標準品的結果也證明，Exploris 480結合Turbo-TMT和FAIMS Pro可顯著提升了樣品的定量深度和準確性（圖4）。
圖4. Turbo-TMT和FAIMS Pro顯著提升定量深度和準確性
3.DIA分析方案
隨著蛋白質組學的進一步發展，尤其對于精zhun醫學、臨床大隊列轉化醫學等研究，DIA分析策略也備受青睞。結合Orbitrap超高分辨質譜在蛋白質組學領域的技術優勢，賽默飛在2018年ASMS上提出了基于微流液相和Orbitrap超高分辨質譜的數據非依賴采集工作流(HRMS1-DIA)，采用超高分辨一級掃描定量策略(R>120,000)。
我們使用已知組成的人、酵母、大腸桿菌混合樣品，在11個實驗室對HRMS1-DIA工作流進行定量準確性和穩定性的長期多中心驗證（圖5）。各實驗室平均可以鑒定到超過8000個蛋白，定量超過6000個蛋白，且定量準確度高于0.9。
圖5. HRMS1-DIA的長期多中心驗證。
A. 蛋白鑒定和定量數量;
B. 實驗室間的蛋白定量散點圖;
C.日間鑒定及定量蛋白的重現性
4.BoxCar分析流程
2018年Matthias實驗室在Nature Methods上發表了全新的BoxCar采集方式，一級全掃采用分段累積合并掃描的方式，降低高豐度肽段對低豐度肽段的信號壓制，提升一級掃描的動態范圍，從而增加血漿等動態范圍大的樣本解析深度（圖6）。
圖6. BoxCar工作流程示意圖
Exploris 480為客戶提供更為便捷的BoxCar DDA 和BoxCar DIA 定量新方案（圖7），極大的豐富了現有的定量流程。
圖7. Orbitrap Exploris™ 480質譜的BoxCar操作界面
5.靶向定量的新思路b
就如眾多研究對高通量信息挖掘的需求一樣，差異蛋白的高可信量化也至關重要。傳統檢測方法多基于免疫反應，常常會受到抗體的可獲得性、特異性和穩定性的困擾。平行反應監測（Parallel Reaction Monitoring,PRM）是Orbitrap超高分辨系列儀器上的靶向定量方法，采用高分辨掃描，可有效排除復雜基質干擾。相比于傳統的SRM和MRM，PRM采用高分辨二級全掃，無需優化碰撞能量，無需子離子，方法開發更加簡單，是目前已被廣泛運用的金標驗證方法。
與此同時，經常也會被問到的一個問題：一針采集中PRM能監測多少條肽段？基于2015年Gallien等人在MCP上發表的IS-PRM思路，Exploris 480上提供了更強健、更便捷的SureQuant定量新方法(圖8)。
圖8. SureQuant定量新方法
SureQuant IS 靶標分析250ng含有50fmol 內標的細胞酶解物，如圖9所示，相比于PRM20%的生產力，SureQuant方法將生產力提高至80%；此外，SureQuant不依賴于預設保留時間，能夠實現可靠穩定的靶標定量。
圖9. SureQuant改善生產力(圖9a)和保留時間漂移(圖9b)的限制
我們以AKT/mTOR通路分析作為一個例子，基于Capillary流速LC-MS平臺，以Hela全蛋白酶解產物為樣品，對AKT/mTOR通路中的12個蛋白/30條肽段進行PRM和SureQuant靶向定量分析。實驗結果表明，SureQuant的肽段檢出效率明顯高于PRM（圖10）。
圖10. SureQuant靶向監測酶解產物中AKT/mTOR 通路的內源肽段
定量蛋白質組學完整解決方案
Orbitrap Exploris™ 480質譜儀作為全新一代Q Orbitrap系列旗艦機，具備ji佳的性能和重現性。擁有LFQ，TMT及TurboTMT，DIA、HR-DIA、BoxCar、PRM及SureQuant等多樣化的定量解決方案，在同一臺儀器上完成從大規模發現到靶向驗證所有工作，是蛋白質組學、精zhun醫學、生物制藥等研究的。
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