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使用Sanger測(cè)序檢測(cè)5%的體細(xì)胞變異

低頻突變是指對(duì)于特定等位基因突變比率少于25%的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，低水平體細(xì)胞變異檢測(cè)對(duì)腫瘤、傳染病、遺傳病等很多研究領(lǐng)域都非常關(guān)鍵。Applied Biosystems™ Minor Variant Finder軟件是一款針對(duì)Sanger測(cè)序檢測(cè)和報(bào)告低頻突變的需要而開(kāi)發(fā)的新型軟件。通常此類低頻變異的拷貝數(shù)非常低，而Minor Variant Finder軟件具有更高的檢測(cè)靈敏度，確保Sanger測(cè)序成為腫瘤學(xué)家和病理學(xué)家檢測(cè)低頻(5%或更低)體細(xì)胞變異的理想選擇。

根據(jù)具體的癌癥類型，使用Minor Variant Finder軟件和金標(biāo)準(zhǔn)的Sanger測(cè)序，可以簡(jiǎn)便快速的檢測(cè)出癌基因(例如KRAS，NRAS等)和抑癌基因(例如TP53)的相關(guān)變異數(shù)，也是驗(yàn)證二代測(cè)序(NGS)檢測(cè)結(jié)果的重要方法。

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可檢測(cè)低至5%的低頻突變 Minor Variant Finder軟件的創(chuàng)新算法在于使用一個(gè)對(duì)照樣本扣除背景噪音，可檢測(cè)低至5%的低頻突變。通過(guò)該軟件限度的降低噪音，導(dǎo)入的Sanger測(cè)序數(shù)據(jù)可形成清晰的電泳圖譜，因此可以直觀的驗(yàn)證這些低頻變異。該軟件還設(shè)置了各種評(píng)審指標(biāo)，有助于在分析之后檢測(cè)出任何可能的低頻變異。正向和反向均可檢測(cè)到低頻變異，進(jìn)而驗(yàn)證相關(guān)結(jié)果。

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更低的成本測(cè)序，1到96個(gè)靶標(biāo)擴(kuò)增子 檢測(cè)有限數(shù)量的靶標(biāo)時(shí)，Sanger測(cè)序是較為經(jīng)濟(jì)的選擇。Minor Variant Finder軟件具有更高的檢測(cè)靈敏度，確保Sanger測(cè)序成為腫瘤學(xué)家和病理學(xué)家檢測(cè)低頻(5%或更低)體細(xì)胞變異的理想選擇。此外，該軟件也提供了一種對(duì)固定的基因試劑盒進(jìn)行擴(kuò)展的簡(jiǎn)單、靈活方法。

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更快獲得關(guān)鍵結(jié)果 充分利用Sanger測(cè)序快速獲得結(jié)果的優(yōu)勢(shì)，從樣本到結(jié)果可在一天內(nèi)完成——讓您更快獲得關(guān)鍵結(jié)果。

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使用比對(duì)視圖和維恩圖，驗(yàn)證NGS結(jié)果 對(duì)于使用NGS技術(shù)的高通量實(shí)驗(yàn)室，NGS結(jié)果中的輕微變異可通過(guò)Sanger測(cè)序驗(yàn)證，此方法快速且成本低廉。驗(yàn)證結(jié)果可通過(guò)比對(duì)視圖和維恩圖直觀顯示。

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簡(jiǎn)單的工作流程 該軟件不需要您變更現(xiàn)有工作流程，可與您實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的Sanger測(cè)序工作流程兼容。

 

使用毛細(xì)管測(cè)序儀、Minor Variant Finder軟件檢測(cè)低頻突變

序言

使用下一代測(cè)序儀和數(shù)字PCR進(jìn)行低頻突變基因的篩選和檢測(cè)，在臨床領(lǐng)域的應(yīng)用受到越來(lái)越多的關(guān)注。通過(guò)超多重PCR擴(kuò)增技術(shù)和新—代測(cè)序儀的Ion AmpliSeq™ Cancer Hotspot Panel v2，僅使用10ng DNA即可—次篩查約2800種突變，通過(guò)正常讀取數(shù)據(jù)和突變讀取數(shù)據(jù)直接比對(duì)，可以計(jì)算突變率。另— 方面，使用經(jīng)典Sanger測(cè)序時(shí)，難以檢測(cè)出低于25%的低頻突變。而本篇文章中介紹的Applied biosystems™ Minor Variant Finder軟件，可通過(guò)毛細(xì)管測(cè)序儀，檢測(cè)出低至5%的低頻突變。同時(shí)，為了驗(yàn)證該軟件所檢測(cè)的突變，同時(shí)結(jié)合數(shù)字PCR (dPCR)方法加以驗(yàn)證。而且，在千葉縣癌癥中心臨床染色體組研究部橫井佐奈部長(zhǎng)的大力協(xié)助下，我們還嘗試使用臨床樣本，檢測(cè)EGFR基因的低頻突變。

 

Minor Variant Finder軟件 

Minor Variant Finder (MVF)軟件是—款為使用毛細(xì)管測(cè)序儀、檢測(cè)低至5%的低頻突變而開(kāi)發(fā)的新型軟件。傳統(tǒng)毛細(xì)管測(cè)序儀的軟件，是根據(jù)突變峰高與主峰高的比值進(jìn)行檢測(cè)，可檢測(cè)25%左右的突變率。而低頻突變的突變峰值隱藏在測(cè)序數(shù)據(jù)的背景噪音中，難以檢測(cè)。

MVF軟件中搭載依托Applied Biosystems長(zhǎng)期使用并被的測(cè)序算法。通過(guò)扣除背景噪音信號(hào)，可通過(guò)對(duì)照樣本中區(qū)分出背景噪聲，目視檢測(cè)出突變峰值。從而檢測(cè)出過(guò)去難以識(shí)別的，低至5%突變的峰值。而且，該軟件可讀取新一代測(cè)序儀的vcf文件，從而比對(duì)新一代測(cè)序儀和毛細(xì)管測(cè)序儀的結(jié)果，并對(duì)檢測(cè)到的突變加以注解。不僅如此，無(wú)需更改以往的實(shí)驗(yàn)流程即可使用新型MVF軟件。使用毛細(xì)管測(cè)序儀的檢測(cè)文件(.ab1文件)，分析更簡(jiǎn)單。

方法及材料 

1. 毛細(xì)管測(cè)序儀

為驗(yàn)證突變，使用人工基因合成服務(wù)lnvitrogen™ GeneArt™ Strings™ DNA Fragments，人工合成包括人體EGFR Exon21區(qū)域在內(nèi)的600bp的DNA (圖4)。合成含有野生型和突變型兩種基因 (COSMIC 6213)的樣本， 分別混合成突變型比例為2.5%、5%、10%、20%、50% 的樣本。使用Applied Biosystems™ BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit，樣品量6ng,  正向引物及反向引物3.2pmol 的條件下，進(jìn)行循環(huán)測(cè)序反應(yīng) 。使用Applied Biosystems™ BigDye™ XTerminator™純化試劑盒純化后，在Applied Biosystems™ 3500xL基因分析儀上，使用POP-7™聚合物、50cm毛細(xì)管陣列進(jìn)行電泳。MVF軟件處理所得數(shù)據(jù)，檢測(cè)突變。

2. 數(shù)字PCR

使用Applied Biosystems™ QuantStudio™3D數(shù)字PCR系統(tǒng)，驗(yàn)證dPCR方法的突變頻率。把同—樣本進(jìn)行倍比稀釋，得到104份重復(fù)樣品，使用QuantStudio 3D預(yù)混液及Applied Biosystems™ TaqMan™SNP基因分型檢測(cè)體系(檢測(cè)ID:C_172767645_10)，進(jìn)行反應(yīng)。

結(jié)果分析 

使用MVF軟件分析毛細(xì)管測(cè)序儀生成的數(shù)據(jù)，可以檢測(cè)出2.5%~50%的所有混合樣品的突變堿基峰值。結(jié)果中顯示所檢測(cè)到的突變，并可以立即確認(rèn)所檢測(cè)的突變位 置信息和突變信息。另外，通過(guò)—鍵點(diǎn)擊，可確認(rèn)檢測(cè)的突變峰值的詳細(xì)信息(圖6A-C)。將檢測(cè)到的突變，匯總整理為基于峰高的突變率，如表1所示。由于ddNTP 的擴(kuò)增效率和所標(biāo)識(shí)的熒光物質(zhì)強(qiáng)度不同等原因，毛細(xì)管測(cè)序儀中沒(méi)有峰高的定量指標(biāo)，所以基于峰高的突變率和dPCR結(jié)果有些許差異。但是，通過(guò)使用MVF軟件，可以檢測(cè)以往無(wú)法檢測(cè)到的2.5%突變樣本。另外，雖然沒(méi)有嚴(yán)格的定量指標(biāo)，但仍可以看出基于峰高的突變率隨著突變型混合比例減少而減少。

這次的實(shí)驗(yàn)中，可以檢測(cè)出包括2.5%這種極低頻率在內(nèi)的所有突變，無(wú)任何假陰性。

另—方面，5個(gè)樣本中共計(jì)檢測(cè)出11個(gè)突變峰值，其中有6處判定為假陽(yáng)性。其突變率低至百分之幾，且在正向結(jié)果和反向結(jié)果中超過(guò)幾倍的差異，其原始數(shù)據(jù)在該位置噪音較大(圖6)。MVF軟件可以直接根據(jù)各自的峰值，并做出判斷，所以可以成為偏離正向和反向的突變率及原始數(shù)據(jù)噪音大小的判斷依據(jù)。

在千葉縣癌癥中心臨床染色體組研究部橫井佐奈部長(zhǎng)的大力協(xié)助下，對(duì)人體樣本也進(jìn)行了相同的突變檢測(cè)。結(jié)果顯示MVF也可檢測(cè)出人體DNA樣本的突變。

 

結(jié)論  

通過(guò)使用MVF軟件，可以從人工合成樣本和實(shí)際人體DNA樣本中，檢測(cè)出傳統(tǒng)軟件難以檢測(cè)的低于25%的突變。另外，在本次驗(yàn)證試驗(yàn)中，甚至可以毫無(wú)遺漏的檢測(cè)到包括2.5%這種極低突變頻率在內(nèi)的所有低頻突變。綜上，展示了本軟件在新—代測(cè)序儀的突變數(shù)據(jù)驗(yàn)證和癌癥研究中低頻突變的檢測(cè)等染色體組的研究中的實(shí)用性，也期待本軟件可以幫助我們進(jìn)—步提高研究的精度和效率。