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摘要在代謝組學(xué)研究中，可靠的代謝物注釋和標(biāo)識對于提供生物學(xué)背景至關(guān)重要。也有助于了解哪些生物化學(xué)通路受到疾病狀態(tài)和候選藥物的影響，從而推進(jìn)基礎(chǔ)生物學(xué)的研究。全面的譜庫有助于解決參與生物通路的代謝物鑒定的關(guān)鍵挑戰(zhàn)，從而助力生物學(xué)解析。本應(yīng)用簡報(bào)介紹了全新的 Agilent Fiehn 精確質(zhì)量代謝組學(xué)個人化合物數(shù)據(jù)庫與譜庫 (PCDL) 及其在使用血漿樣品進(jìn)行的靶向和非靶向篩查工作流程中的表征和評估。為代謝組學(xué)應(yīng)用提供精確質(zhì)量 GC/MS 譜庫使研究人員能夠擴(kuò)大復(fù)雜生物基質(zhì)中代謝物鑒定的范圍、靈敏度和可靠性。

前言長期以來，GC/MS氣質(zhì)聯(lián)用儀 一直被視為重要的靶向和非靶向代謝物分析工具。它憑借穩(wěn)定的性能、尖銳的峰形和可重現(xiàn)的電子電離(EI) 源譜圖在代謝物的鑒定中得到廣泛使用。最近，隨著高分辨率精確質(zhì)量飛行時間 (TOF) 儀器的問世，研究人員擁有了更強(qiáng)大的資源，能夠更可靠地鑒定更多的生物相關(guān)分子。事實(shí)證明，GC/MS 質(zhì)譜庫是輕松實(shí)現(xiàn)快速化合物鑒定的重要工具[1–4]。保留時間/指數(shù)和精確質(zhì)量信息為確認(rèn)或否決化合物鑒定結(jié)果提供了更多的證據(jù)，同時可有效降低假陽性率[5,6]。精確質(zhì)量 GC/MS 譜庫特別適用于涉及復(fù)雜基質(zhì)或目標(biāo)化合物分子式較為復(fù)雜的應(yīng)用，代謝組學(xué)應(yīng)用就是其中之一。為了幫助提高代謝組學(xué)應(yīng)用的可靠性和通量，創(chuàng)建了生物基質(zhì)中常見化合物的精確質(zhì)量保留時間鎖定 (RTL) EI 譜庫。該譜庫包含 900多個條目，涵蓋了廣泛的化合物類別。使用血漿樣品通過靶向和非靶向篩查工作流程對精確質(zhì)量代謝組學(xué) PCDL 庫進(jìn)行了測試。此外，研究表明，精確質(zhì)量代謝組學(xué) PCDL 庫可用于鑒定各種組織樣品中的代謝物和共流出代謝物。

實(shí)驗(yàn)部分樣品前處理對代謝物進(jìn)行衍生化是提高極性代謝物的揮發(fā)性，使其更適用于 GC/MS 分析的常用方法。根據(jù)其他研究所述，本研究將代謝物標(biāo)樣、血漿和組織提取物進(jìn)行甲氧基化衍生，然后采用 MSTFA + 1% TMCS 進(jìn)行硅烷化[7]。在進(jìn)行衍生化前，向每個樣品中加入 D27 肉豆蔻酸作為內(nèi)標(biāo)。使用乙腈:異丙醇:水(3:3:2) 從血漿和組織中提取代謝物。干燥物的提取和衍生化過程如前所述，然后用其來評估精確質(zhì)量譜庫的篩查工作流程。

數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理使用精確質(zhì)量高分辨質(zhì)譜儀 Agilent 7250 GC/Q-TOF 系統(tǒng)采集已知色譜分離良好的單標(biāo)或代謝物混合物的 EI 譜圖。包括標(biāo)準(zhǔn)品和提取物在內(nèi)的所有數(shù)據(jù)均在 70 eV 的 EI 模式下獲得。數(shù)據(jù)采集參數(shù)見表 1。精確質(zhì)量代謝物 PCDL 中各化合物的保留指數(shù) (RIs) 都是基于脂肪酸甲酯和正構(gòu)烷烴計(jì)算得到的。使用 Agilent MassHunter 10 版定性分析軟件將精確質(zhì)量 EI 碎片轉(zhuǎn)換為理論 m/z 值。然后，使用 Agilent PCDL Manager 8.0 版軟件將譜圖導(dǎo)入精確質(zhì)量代謝組學(xué) PCDL。使用全新的譜庫管理軟件 Agilent ChemVista 1.0 對 PCDL 進(jìn)行了進(jìn)一步的修改，增加了關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)和化學(xué)結(jié)構(gòu)信息。使用 Agilent MassHunter定量分析軟件（10.2 版和 11.1 版）（包括未知物分析軟件工具）對數(shù)據(jù)進(jìn)行了處理。

結(jié)果與討論構(gòu)建精確質(zhì)量代謝組學(xué) PCDL精確質(zhì)量代謝物 PCDL 當(dāng)中的化合物都是經(jīng)過挑選的，確保包含大多數(shù)參與主要代謝通路并適合進(jìn)行 GC/MS 分析的代謝物。此外，為了擴(kuò)大譜庫的適用范圍和效用性，還添加了250 多種生物基質(zhì)中常見的次級代謝物和外源性物質(zhì)。為了將所采集譜圖中的每個碎片離子 m/z 數(shù)值轉(zhuǎn)換為理論值，MassHunter 定性軟件會自動給譜圖中的碎片離子標(biāo)注其對應(yīng)的化學(xué)式。在將譜圖導(dǎo)出到 PCDL 之前，如有必要，可以對自動標(biāo)注的化學(xué)式手動進(jìn)行審查和更改（圖 1）。在 ChemVista譜庫管理軟件中添加化學(xué)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)標(biāo)識符（InChI String、InChIKey、SMILES）和各種數(shù)據(jù)庫標(biāo)識符（CAS、PubChemID 等）等關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)。GC/Q-TOF 的精確質(zhì)量代謝組學(xué) PCDL 庫包含保留指數(shù)（基于正構(gòu)烷烴和脂肪酸甲酯）。當(dāng)前版本的譜庫包含 900 多張精確質(zhì)量 EI 譜圖，對應(yīng) 670 多種化合物。