簡介

神經突增生是體外研究神經元發育和神經元變性的常用檢測。神經突的發展需要胞外和胞內信號的復雜相互作用。神經營養因子可以刺激或抑制神經突的生長。重要的是，神經元的發育會受到神經毒性化學物質的影響。

我們在 ImageXpress Pico 自動化細胞成像系統上評估了神經軸突生長檢測，以測定化合物對發育中的神經系統產生不利影響的能力。選擇該測定法是因為其作為神經系統發育中的關鍵過程，神經元在神經系統發育中擴展其神經突以形成完整的神經網絡。總神經突增生通常是報告的最常見指標，而總分支和總過程等其他參數可能代表化合物可能抑制神經突增生的其他模式。

我們評估了化合物對神經突生長的特異性影響，包括通過多重測量定量表征神經網絡的范圍和復雜性。使用多次測量表征神經突生長的表型讀數。神經突增生的特征是生長程度（每個細胞的總生長長度或平均生長）、神經突進程數（進程總數）和分支程度（每個細胞的總分支數和平均分支數）。

優勢

• 評估化合物對神經突生長的特異性影響

• 通過多重測量定量表征神經網絡的范圍和復雜性

•  利用檢測來研究體外神經元發育和神經元變性

Materials

• iPSC 源性神經元（人神經元試劑盒、NEURO KIT、XK-001-1V、XCell Science Company）

•  Poly-D-lysine 預包被 384 孔板（Corning Biocoat）

• 層粘連蛋白 （Sigma-Aldrich）

•  Hoechst （ThermoFisher Scientific）

•  Hank 的平衡鹽溶液（Life Technologies）

• ImageXpress Pico 自動化細胞成像系統 （Molecular Devices）

• CellReporterXpress® 圖像采集和分析軟件（Molecular Devices）

方法

將 iPSC 源性神經元接種在經 3.3 mg/mL 層粘連蛋白處理的聚-D-賴氨酸預包被 384 孔板上。每孔接種一萬個細胞，并在化合物處理前在 iCell Neuron 維護培養基中維持 48 小時。這些細胞中的神經突網絡通常在接種后 2 小時開始形成，并且在培養中復雜性增加長達 10-12 天。按照制造商的建議，將神經元培養 14 天，然后在384 孔板中的 6 點濃度范圍 （0.3-100 uM）。通過量化每孔的總生長、分支、過程和活細胞數量來評估對神經突生長的影響。使用 EC50值評估濃度-反應依賴性。

將細胞在 37°C 和 5% CO2 下暴露于化合物中72小時。接下來，取出培養基，用 4% 甲醛固定細胞，洗滌 2 次，然后用 1：100 的 AF-488 結合鬼筆環肽和 1 um Hoechst 33342 在無菌 Hank’s 平衡鹽溶液中孵育 2 小時。Calcein AM 被用作神經突增生和細胞活性的標記物。孵育后，用含 0.1% 胎牛血清 （FBS） 的磷酸鹽緩沖鹽水 （PBS） 代替染色溶液，以進行圖像采集。

使用 10X 物鏡，使用 ImageXpress Pico 系統采集單個孔的圖像。通常，在 384 孔板中，每個孔捕獲一個 10X 圖像。10X物鏡可提供足夠的分辨率，以區分每張圖像中相對大量的細胞 （>200） 中的神經突網絡和亞細胞結構，約占孔總面積的 1/6。使用 CellReporterXpress 軟件進行實時分析，該軟件包含用于神經突追蹤的分析模塊。圖 1 顯示了來自 DMSO 處理的神經元的代表性放大圖像，該神經元具有神經突追蹤疊加。

圖 1：使用 &-微管蛋白（綠色）染色和 CellReporterXpress 軟件分析軌跡顯示的對照和化合物處理細胞的神經元代表性圖像。XCell 神經元用化合物處理三天，然后固定并用 AF488-conJugated anti-&-tubulin （TUJ-1） 抗體 （1：100） 染色。ImageXpress Pico 系統使用 10X Plan Fluor 物鏡以及 FITC 和 DAPI 通道拍攝圖像。使用神經突追蹤分析方案處理圖像。分析掩膜顯示生長（綠色）、細胞體（藍色）和分支點（粉色）。

結果

我們觀察到化合物處理后神經突網絡形成呈劑量依賴性抑制（圖 2）。對這些實驗中捕獲的圖像進行定量分析，包括推導多個參數，以便評估培養神經元的形態特征以及神經元網絡的復雜性程度和程度。還定量了圖像中總細胞體的數量，以估計化合物誘導的細胞毒性。由于整個實驗中的細胞鋪板和神經突生長非常一致且一致，因此我們使用每張圖像的神經元總數進行統計分析。每個細胞生長的長度或每個細胞的過程或分支也被測量，但由于冗余，因此不用于統計分析。化合物的毒性效應可通過 EC5 值（50% 神經突生長抑制的化合物濃度）進行比較，該值源自神經突生長的 4 參數曲線擬合、分支數量、工藝或活細胞數量。圖 2 顯示了各種化合物（1 uM 濃度）中神經突網絡總長度（總生長）的濃度依賴性曲線，以評估其潛在的神經毒性作用并優先考慮進一步的毒性評估。圖 3 和 4 顯示了在 10 uM 濃度下測試的神經毒性化合物。

圖 2. 對于用 1 AM 指示化合物處理的神經元，測量神經突網絡的破壞。EC50 值由總生長減少、羅登酮為 6 pM、甲基汞為 0.07 pM 來定義。定義分支點減少的 EC50 值，羅登酮為 3 pM，甲基汞為 0.07 pM

圖 3. 在 10 pM 濃度下測試的神經毒性化合物的圖像。

圖 4. 在 10 pM 濃度下測試的神經毒性化合物的平均神經突生長。

結論

該檢測可用于研究神經突增生的不同調節劑以及體外神經毒性效應。