自噬是干預(yù)治療的一個(gè)潛在領(lǐng)域

自噬是隔離和降解那些被識(shí)別為錯(cuò)誤或者僅僅是不再被細(xì)胞需要的蛋白和細(xì)胞器的一個(gè)胞內(nèi)分解代謝過(guò)程。自噬通過(guò)實(shí)施清除入侵微生物、錯(cuò)誤折疊蛋白及退化的細(xì)胞器等“管家"功能來(lái)支持正常的細(xì)胞進(jìn)程。自噬對(duì)于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)很關(guān)鍵。除了作為細(xì)胞物質(zhì)周轉(zhuǎn)機(jī)制，自噬還能通過(guò)調(diào)節(jié)能量消耗速率及物質(zhì)再利用等過(guò)程來(lái)支持生命體應(yīng)對(duì)饑餓等挑戰(zhàn)。

自噬在癌癥、傳染性疾病、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病及其他疾病中發(fā)揮著有益或有害的作用。自噬在神經(jīng)細(xì)胞研究方面令人特別感興趣，因?yàn)樗鼛兔S持著蛋白結(jié)構(gòu)使其能在很長(zhǎng)的軸突距離上發(fā)揮作用。與其他組織細(xì)胞不同，神經(jīng)元的胞質(zhì)內(nèi)容物并不會(huì)被有絲分裂常規(guī)稀釋。在阿爾茨海默病、帕金森病及其他神經(jīng)紊亂中發(fā)現(xiàn)自噬發(fā)生改變且細(xì)胞毒素積累。這些觀察結(jié)果導(dǎo)致了關(guān)于自噬作為干預(yù)治療潛在領(lǐng)域各種機(jī)制的思考。定量實(shí)驗(yàn)變量對(duì)這一過(guò)程的影響是研究的基本要素，可能導(dǎo)致開發(fā)針對(duì)自噬的安全有效的治療方法。

益處

生成未標(biāo)記的神經(jīng)突起的準(zhǔn)確分割

更深入的了解神經(jīng)退行性疾病的機(jī)制

更精確地區(qū)分相似的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)

在單個(gè)孔中測(cè)量多種生物學(xué)以生成豐富的數(shù)據(jù)

材料

CYTO-ID® 自噬試劑（恩佐生命科學(xué)）

熒光溶酶體染料

iCell® 人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生神經(jīng)元（細(xì)胞動(dòng)力學(xué)國(guó)際）

大鼠PC-12細(xì)胞（ATCC, cat no. CRL-1721）

ImageXpress® 顯微高內(nèi)涵成像系統(tǒng)（美谷分子儀器）

MetaXpress® 高內(nèi)涵圖像獲取及分析軟件（美谷分子儀器）

通過(guò)熒光成像觀察自噬

即使在異質(zhì)細(xì)胞群中，也可以使用現(xiàn)成的試劑對(duì)自噬進(jìn)行可視化和表征。

CYTO-ID自噬試劑選擇性地對(duì)吞噬團(tuán)、自噬體和自溶酶體的膜進(jìn)行染色。它還被證明與自噬體蛋白LC3-II共定位。它具有 495/519 nm 的熒光激發(fā)/發(fā)射曲線，可與標(biāo)準(zhǔn) FITC 濾光片組一起使用。借助溶酶體特異性熒光可視化，可以檢測(cè)與溶酶體的破壞性自噬體融合（圖1）。在下面的示例中，使用激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為 647/668 nm 的熒光溶酶體染料來(lái)表征溶酶體活性。標(biāo)準(zhǔn) Cy5 濾光片組可用于檢測(cè)深紅色溶酶體染料的發(fā)射。

圖1. 當(dāng)內(nèi)部或外部信號(hào)促進(jìn)吞噬團(tuán)（球形雙膜隔離結(jié)構(gòu)）的形成時(shí)，自噬過(guò)程就開始了。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3α（LC3）刺激吞噬團(tuán)的伸長(zhǎng)，其開始吞噬細(xì)胞質(zhì)靶標(biāo)。在由自噬相關(guān)（ATG）蛋白介導(dǎo)的過(guò)程中，吞噬細(xì)胞在靶標(biāo)周圍關(guān)閉，成為自噬體。然后，自噬體與溶酶體融合，使其內(nèi)容物和自身膜被水解酶降解1。

能夠同時(shí)分析表型變化

活細(xì)胞中自噬體的CYTO-ID Green染色和溶酶體染色水平提供了有關(guān)化合物刺激或抑制自噬途徑的機(jī)制的信息。這是使用 ImageXpress 顯微系統(tǒng)完成的，這是一種高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)，用于對(duì)固定或活細(xì)胞、組織和小生物體進(jìn)行寬場(chǎng)熒光或明場(chǎng)成像（圖 2）。

MetaXpress軟件使用預(yù)配置的應(yīng)用程序或定制模塊分析圖像，以表征表型變化并產(chǎn)生特定的輸出。定制模塊能夠同時(shí)檢測(cè)、測(cè)量和對(duì)多個(gè)染色小體（如細(xì)胞核、自噬體和溶酶體）進(jìn)行面積求和。測(cè)量值隨時(shí)間推移或?qū)φ諏?shí)驗(yàn)條件（例如一系列藥物化合物濃度）繪制。

圖2. 使用自動(dòng)成像簡(jiǎn)化定量工作流程。簡(jiǎn)單和自動(dòng)化的工作流程適用于高通量篩選，即使對(duì)于從鋪板到最終結(jié)果可能需要數(shù)天的實(shí)驗(yàn)，也只需要最少的手動(dòng)操作時(shí)間。

自噬體數(shù)量增加提示細(xì)胞窘迫

iCell人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）衍生神經(jīng)元和大鼠PC-12細(xì)胞用于證明在384孔微孔板的每個(gè)孔中測(cè)試多個(gè)細(xì)胞反應(yīng)的效用。

人類神經(jīng)元

神經(jīng)元以5000個(gè)細(xì)胞/孔接種，并按照制造商的建議進(jìn)行生長(zhǎng)。5天后，用在維持培養(yǎng)基中制備的一系列稀釋化合物處理細(xì)胞。化合物孵育24小時(shí)后，對(duì)溶酶體、細(xì)胞核和自噬體進(jìn)行染色，并使用ImageXpress顯微系統(tǒng)將腔室加熱至37°C對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行成像。使用60× Plan Fluor或40× Plan Apo物鏡從每孔2-4個(gè)位點(diǎn)獲取圖像（圖3A）。使用MetaXpress軟件完成圖像分析，以量化暴露于一系列濃度的實(shí)驗(yàn)化合物的影響（圖3B）。雖然示例圖像出于說(shuō)明目的以60倍放大倍數(shù)顯示細(xì)胞，但圖3-6中的圖表中的數(shù)據(jù)來(lái)自相同的實(shí)驗(yàn)，但使用40倍放大倍數(shù)。較低的放大倍率可生成足夠質(zhì)量的圖像來(lái)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)囊泡，同時(shí)提供在每個(gè)視野內(nèi)捕獲更多細(xì)胞的好處。

大鼠PC-12細(xì)胞

將PC-12細(xì)胞以2000個(gè)細(xì)胞/孔接種并培養(yǎng)過(guò)夜，然后用在培養(yǎng)基中制備的系列稀釋化合物進(jìn)行處理。24小時(shí)后，對(duì)溶酶體、細(xì)胞核和自噬體進(jìn)行染色，并在37°C下對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行成像。 在40×放大倍率下從每孔2-4個(gè)位點(diǎn)獲取圖像。使用MetaXpress軟件完成圖像分析，以定量暴露于一定濃度范圍內(nèi)的實(shí)驗(yàn)化合物的影響（圖4）。

溶酶體反應(yīng)提示自噬途徑中斷

人類神經(jīng)元

溶酶體的測(cè)定在與前面描述的相同的孔中進(jìn)行，并具有相同的程序，但添加了溶酶體染料（圖5）。

大鼠PC-12細(xì)胞

在PC-12細(xì)胞中進(jìn)行相同的測(cè)定以測(cè)量多種毒性事件。測(cè)量幾個(gè)參數(shù)以確定對(duì)細(xì)胞內(nèi)溶酶體的影響（圖6）。

圖3. 定量暴露于實(shí)驗(yàn)化合物對(duì)人類神經(jīng)元的影響。（A）暴露于三種不同濃度的三種不同化合物后人類神經(jīng)元的代表性60倍放大圖像。自噬體（綠色）以劑量依賴性方式對(duì)細(xì)胞治療作出反應(yīng)。（B）氯喹、魚藤酮和維拉帕米對(duì)人神經(jīng)元聚集自噬體區(qū)域的劑量反應(yīng)作用。自噬體可能被化合物暴露抑制或刺激。

圖4. 暴露于實(shí)驗(yàn)化合物對(duì)大鼠PC-12細(xì)胞的影響的量化。（A）暴露于三種不同濃度三種不同化合物后的大鼠PC-12細(xì)胞的代表性60倍放大圖像。自噬體(綠色)可以清晰地可視化和測(cè)量。（B）氯喹、魚藤酮和維拉帕米對(duì)大鼠PC-12細(xì)胞中自噬體總面積的劑量反應(yīng)效應(yīng)。自噬體可能受到化合物暴露的抑制或刺激。

圖5. 人類神經(jīng)元中溶酶體反應(yīng)的量化。（A）暴露于三種不同濃度的三種不同化合物后iPSC衍生神經(jīng)元的代表性圖像。溶酶體（紅色）可以可視化和測(cè)量以檢測(cè)反應(yīng)。（B）氯喹、魚藤酮和維拉帕米對(duì)神經(jīng)元中總?cè)苊阁w面積的劑量反應(yīng)效應(yīng)，這是自噬的第二種測(cè)量。溶酶體測(cè)量可以表明在兩個(gè)囊泡融合的最后一步自噬體途徑的破壞。

圖6. 大鼠PC-12細(xì)胞中溶酶體反應(yīng)的定量。（A）暴露于三種不同濃度的三種不同化合物后大鼠PC-12細(xì)胞的代表性圖像。上述圖像是使用60× PF物鏡采集的。溶酶體以紅色顯示。定量細(xì)胞內(nèi)溶酶體的減少或增加為化合物的毒性機(jī)制提供了線索。（B）氯喹、魚藤酮和維拉帕米對(duì)大鼠PC-12細(xì)胞中聚集溶酶體區(qū)域的劑量反應(yīng)效應(yīng)，這是自噬的第二種測(cè)量。溶酶體可能受到化合物暴露的抑制或刺激。

圖7. 使用自定義模塊的神經(jīng)元分割。（左）透射光（灰色）、Hoechst染色的細(xì)胞核（藍(lán)色）和CYTO-ID染色的自噬體（綠色）的放大40倍放大圖像的疊加。（右）分割掩碼，其中細(xì)胞體和從透射光圖像中識(shí)別為藍(lán)綠色的副產(chǎn)物，健康細(xì)胞核被識(shí)別為黃色，凋亡細(xì)胞核被識(shí)別為粉紅色，自噬體被寶藍(lán)色識(shí)別。即使遠(yuǎn)離細(xì)胞體（如箭頭所指），也可以對(duì)自噬體進(jìn)行計(jì)數(shù)。

使用透射光圖像生成準(zhǔn)確的神經(jīng)元分割

檢測(cè)遠(yuǎn)離細(xì)胞體的神經(jīng)突生長(zhǎng)物中的自噬體可能具有挑戰(zhàn)性。獲得未染色細(xì)胞體的明場(chǎng)圖像有助于分段具有長(zhǎng)過(guò)程的細(xì)胞。為了僅精確量化與神經(jīng)元相關(guān)的染色細(xì)胞器構(gòu)建了一個(gè)定制模塊。這確保了僅檢測(cè)感興趣的細(xì)胞對(duì)象，而不是染色的人工制品或碎片（圖7）。

AcuityXpressTM分析軟件創(chuàng)建了自定義模塊分析生成的讀數(shù)劑量反應(yīng)曲線（圖8）。維拉帕米和氯喹均觀察到明顯的自噬體形成劑量依賴性反應(yīng)。圖9列出了自噬體和溶酶體形成所觀察到的化合物抑制或刺激自噬的EC50值。

圖8. 維拉帕米和氯喹自噬體形成的劑量反應(yīng)曲線。使用圖7中定義的自定義模塊分析圖像，生成的測(cè)量值用于在AcuityXpress分析軟件中繪制曲線。

圖9. 被測(cè)化合物的EC50值。通過(guò)將劑量反應(yīng)曲線擬合到非線性模型來(lái)計(jì)算抑制或刺激自噬的化合物的EC50值。不同的細(xì)胞類型對(duì)藥物暴露表現(xiàn)出不同的敏感性并不意外。

結(jié)論

我們證明了評(píng)估特定神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物中相對(duì)于實(shí)驗(yàn)條件的自噬的能力。這為研究人員提供了檢查實(shí)驗(yàn)化合物對(duì)神經(jīng)元自噬的劑量反應(yīng)影響或篩選可能影響自噬的化合物庫(kù)的機(jī)會(huì)，從而篩選與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的神經(jīng)元生理機(jī)制。 

ImageXpress顯微系統(tǒng)提供了一系列功能，包括寬場(chǎng)高分辨率明場(chǎng)和多波長(zhǎng)熒光顯微鏡，能夠捕獲在384孔微孔板中培養(yǎng)的人和大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的圖像。MetaXpress軟件能夠分析這些圖像，并繪制實(shí)驗(yàn)條件與自噬發(fā)生之間的關(guān)系，通過(guò)測(cè)量的自噬體，溶酶體和其他可視化細(xì)胞成分的聚集面積進(jìn)行量化。

參考文獻(xiàn)

1. Mizushima, Yoshimori and Levine (2010) Methods in Mammalian Autophagy Research. Cell 140:313-326.

2. Jin H. Son, et. al. (2012) Neuronal autophagy and neurodegenerative diseases. Experimental and Molecular Medicine 44, 2:89-98.