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動物細胞β-半乳糖苷酶活性化學發光法定量檢測試劑盒產品說明書 主要用途 動物細胞β-半乳糖苷酶活性化學發光法定量檢測試劑是一種旨在使用化學方法，快速有效地裂解動物細胞，通過高速離心，獲得澄清細胞裂解懸液，在β-半乳糖苷酶反應體系里，以人工合成的二惡二酮類化合物作為發光底物，水解所產生的發光產物，通過發光探測儀（Luminometer）測定其相對冷光單位（RLU）的變化，以此進行測算酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。廣泛應用于基因組學、蛋白質組學和其它分子生物學研究。其適用于轉基因后的活體細胞外源性以及衰老細胞內源性半乳糖苷酶活性分析。產品即到即用，性能穩定，參數優化，操作簡便、高度敏感。 技術背景 大腸桿菌的標志基因Lac Z編碼β-半乳糖苷酶（β-galactosidase ； β-gal），在其催化作用下，半乳糖可從乳糖的水解作用中得到。β-半乳糖苷酶非常穩定，對蛋白水解降解作用抗性強，且容易測試。因此β-半乳糖苷酶成為目前常用的報告基因，以評價載體轉染的效果。在衰老細胞內，顯示β-半乳糖苷酶活性。甲氧基二惡二酮氯代金剛烷苯基吡喃半乳糖苷（3- (4-methoxyspiro [1, 2-dioxetane-3, 2'- (5'-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7]-decan]-4-yl-phenyl -ß-D-galacto pyranoside），是一種二惡二酮（dioxetane）類發光底物，以替代乳糖，在β-半乳糖苷酶（pH7.8）的催化下，去糖基化后，產生二惡二酮，進而在多聚苯甲基乙烷乙烯基苯甲氯化銨和熒光素鈉（poly (benzyldimethylvinylbenzyl) ammonium chloride and sodium fluorescein）的啟動反應作用下，同時pH調整到12，由此二惡二酮分解，發出冷光，在冷光儀（475nm波長）下，檢測發光信號，來測定β-半乳糖苷酶的活性。其發光產物半衰期為10分鐘，檢測敏感度可達20飛克（fg）。 ? 產品內容 清理液（Reagent A） 毫升 裂解液（Reagent B） 毫升 稀釋液（Reagent C） 微升 反應液（Reagent D） 微升 堿性液（Reagent E） 毫升 啟動液（Reagent F） 微升 陰性液（Reagent G） 毫升 產品說明書 1份 保存方式 保存裂解液（Reagent B）、反應液（Reagent D）和啟動液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在4℃冰箱里；反應液（Reagent D）和啟動液（Reagent F）避免光照；堿性液（Reagent E）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月 用戶自備 β-半乳糖苷酶標準樣：用于建立β-半乳糖苷酶標準曲線 15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器 1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器 細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離 （微型）臺式離心機：用于樣品操作 黑色96孔板或酶標板：用于冷光檢測操作的容器 恒溫水槽或培養箱：用于反應物孵育 冷光儀：用于樣品冷光檢測 實驗步驟 實驗開始前，開啟化學發光儀預熱，設置波長475nm；開啟恒溫水槽，設置溫度為37℃。同時從－20℃冰箱里取出裂解液（Reagent B）和反應液（Reagent D）等置于冰槽里融化；反應液（Reagent D）和啟動液（Reagent F）避免光照。然后進行下列操作： 一、樣品準備 1．準備好25cm2細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 106細胞） 2．小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面 3．小心抽去清理液 4．使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化） 5．加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細胞 6．移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始） 7．放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g 8．小心抽去上清液 9．加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻 10．轉移到預冷的1.5毫升離心管 11．強力渦旋震蕩15秒 12．置于冰槽里孵育30分鐘 13．放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415） 14．小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管 15．移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用Bradford蛋白質濃度定量試劑盒) 16．即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作 二、測定準備 1．從-70℃取出上述制備的待測樣品，置于冰槽里 2．反應液（Reagent D）和啟動液（Reagent F）嚴格注意避光 3．設定好化學發光儀：溫度為30℃預熱和運行程序（清洗步驟等）：整合5秒，并置零 4．然后關掉實驗室的燈光 三、活性檢測 檢測開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置入冰槽里融化；然后移出xx微升稀釋液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升反應液（Reagent D），輕柔混勻后，置于冰槽里，標記為反應工作液，放在暗室里。同時移出xx微升堿性液（Reagent E）到另一新的1.5毫升離心管，加入xx微升啟動液（Reagent F），輕柔混勻后，置于冰槽里，標記為啟動工作液，放在暗室里。然后進行下列操作。 1．準備1個黑色96孔酶標板，并做好標記：包括背景對照和待測樣品 2．分別加入xx微升反應工作液到所有測試孔里 3．加入xx微升陰性液（Reagent G）到背景對照孔里 4．加入5微升待測樣品（50微克細胞裂解懸液蛋白）到待測樣品孔里 5．輕輕搖動酶標板，混勻 6．室溫下孵育60分鐘，避免光照 7．分別加入xx微升啟動工作液到所有測試孔里 8．輕輕搖動酶標板，混勻 9．室溫下靜置10秒，嚴格避免光照 10．即刻放進冷光儀檢測：5秒整合檢測 11．獲得相對發光單位（Relative Light Unit；RLU） 四、樣品活性分析 五、樣品β-半乳糖苷酶實際活性單位計算（建議使用 β-半乳糖苷酶標準曲線化學發光法測定試劑盒） 1)構建β-半乳糖苷酶標準曲線：橫座標（x軸）為每毫升β-半乳糖苷酶單位濃度；縱坐標（y軸）為標準樣品讀數（吸光單位OD值） 2)根據β-半乳糖苷酶標準曲線，測算樣品中含有β-半乳糖苷酶的活性單位（單位/毫克樣品） 注意事項 1．本產品為20次操作 2．建議使用核內表達的載體代替胞內表達的載體轉染或感染細胞或組織 3．本產品的各項參數達到優化 4．操作時，須戴手套 5．反應液（Reagent D）和啟動液（Reagent F）具有光高度敏感性，因此整個操作須避光進行，避免反復凍融 6．測讀的所有步驟均須在暗室里進行 7．系統操作過程中，背景測定只需1次 8．用戶可以測定細胞裂解懸液的蛋白濃度，便于計算活性單位之需；建議使用 Bradford蛋白質濃度定量檢測試劑盒 9．加入啟動工作液10秒后，即刻進行冷光測定 10．如果用戶沒有冷光儀，可以使用閃爍探測器（scitillation counter 或β計數器）替代，但敏感性較低 11．如果是注射式冷光儀，建議測試前后使用無離子水沖洗冷光儀注射（injector）管道 12．相對發光讀數RLU（Relative Light Unit）越高，表明酶活性越高 13．測定后，測定杯須清洗* 14．建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升；如果樣本酶活性過低，則可以增加樣本量 15．用戶可以使用β-半乳糖苷酶構建標準曲線，進行樣品酶活性單位檢測或使用 β-半乳糖苷酶標準曲線化學發光法測定試劑盒 16．本公司提供系列β-半乳糖苷酶檢測試劑產品 質量標準 1．本產品經鑒定性能穩定 2．本產品經鑒定檢測敏感