前言
乳鐵蛋白，這一名字中的“蛋白”源自拉丁文“proteios”，寓意著它在自然界中的至關(guān)重要的地位。它是天然存在于哺乳動物乳汁中的一種特殊蛋白質(zhì)。在人體內(nèi)，蛋白質(zhì)是構(gòu)建身體組織、調(diào)節(jié)生理功能的重要物質(zhì)，而乳鐵蛋白更是其中的佼佼者，作為一種非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，它的重要性不言而喻。
近年來，乳鐵蛋白應用越來越廣泛，不僅是牛奶中的營養(yǎng)寶藏，還因為其強大的抗菌、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用，在保健品、嬰幼兒配方奶粉及護膚品領(lǐng)域中嶄露頭角。然而，乳鐵蛋白對外部環(huán)境，尤其是溫度的變化非常敏感。一旦溫度過高，就極易破壞其穩(wěn)定性，進而影響其功能的正常發(fā)揮。
為了解決這一技術(shù)難題，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了新的行業(yè)標準NY/T 4439-2023（2024.5.1實施），該標準詳細介紹了一種高效液相色譜法用于奶及奶制品中乳鐵蛋白的測定。這一方法的實施，將有助于我們更準確地檢測牛奶中未變性的乳鐵蛋白含量，從而為奶業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展提供有力支持。
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實驗部分
色譜條件
賽里安LC6000超高效液相色譜
表1. 方法參數(shù)
試劑及標準品配置
乙腈（HPLC級）；三氟乙酸（HPLC級）；
牛乳鐵蛋白（編號：CDAA-200251）
①磷酸鹽緩沖液Ⅰ：稱取7.1 g磷酸氫二鈉、58.4 g氯化鈉，加900 mL水溶解，用磷酸調(diào)pH至8.0±0.2，加水定容至1000 mL，臨用現(xiàn)配。
②磷酸鹽緩沖液Ⅱ：稱取28.4 g磷酸氫二鈉，加800 mL水溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.5±0.2，再加入20 mL乳鐵蛋白結(jié)合液A，加水稀釋至1000 mL。
Tip：使用磷酸鹽緩沖液來配制標準品溶液和稀釋待測樣品，提取其中乳鐵蛋白。這一步的原理是乳鐵蛋白在適當?shù)膒H值和離子強度條件下具有良好的溶解性。而磷酸氫二鈉可以通過調(diào)節(jié)溶液的pH值和離子強度，有助于乳鐵蛋白從食品基質(zhì)（如牛乳、乳粉等）中溶解出來。在提取過程中，磷酸氫二鈉提供的緩沖環(huán)境能夠保護乳鐵蛋白不受酸堿變化的影響，從而保持其穩(wěn)定性和生物活性。提取后的離心操作，將溶解了乳鐵蛋白的緩沖液與食品基質(zhì)中的不溶物分離，以便后續(xù)純化和檢測。
結(jié)果
示例圖譜
乳鐵蛋白分離度好，出峰尖銳，詳見圖1。
圖1 乳鐵蛋白50mg/L示例色譜圖
標準曲線
將乳鐵蛋白標準溶液依次稀釋為0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0mg/L使用外標法進行標準定量 ，以濃度為橫坐標峰面積為縱坐標作外標工作曲線 ；乳鐵蛋白響應值和濃度呈良好的線性關(guān)系，所得到的相關(guān)系數(shù)在0 .9990以上，詳見圖2。
圖2 乳鐵蛋白0-100mg/L重疊圖
重現(xiàn)性
乳鐵蛋白峰面積RSD%=1.66（n=6）保留時間RSD%=0.03（n=6）結(jié)果見表3。
圖3 乳鐵蛋白50mg/L重疊圖（n=6）
結(jié)論
由實驗結(jié)果可以看出，采用賽里安LC6000 UHPLC系統(tǒng)可以實現(xiàn)對乳鐵蛋白的檢測，靈敏度、穩(wěn)定性、線性均滿足需求。
實驗總結(jié)
①乳鐵蛋白結(jié)合液A放置時間過長可能會出現(xiàn)沉淀，使用前搖勻即可。
②配制磷酸鹽緩沖液Ⅱ時，調(diào)pH前的溶液pH值應在9.00以上，否則提取效率會降低。調(diào)完pH后加乳鐵蛋白結(jié)合液A然后定容，定容后混勻即可，不需要劇烈攪拌；
③首次使用ChromCore 300 C4-T色譜柱時，可能會出現(xiàn)色譜峰型不對稱或響應低的情況，此時需要使用高濃度牛乳鐵蛋白對照品（400 μg/mL進樣100 μL）對色譜柱進行鈍化處理，鈍化后將色譜柱沖洗至無牛乳鐵蛋白的目標峰后，再進行樣品分析；
④因為蛋白在C4分析柱上會有一定殘留，建議在做柱容量測試后，空針進樣兩次把蛋白殘留降低后再進行后續(xù)測試
⑤色譜柱使用結(jié)束后，需用純乙腈沖洗30 min對色譜柱進行保存，保證下次色譜柱可以正常使用。
寫在最后
檢測乳鐵蛋白含量的實驗并不復雜，但是也是食品安全防線中的一部分。除了乳鐵蛋白的檢測，賽里安還有多種產(chǎn)品和方案用于食品科學研究，這些產(chǎn)品方案在默默守護健康安全的餐桌的同時，也不斷助力食品科學的發(fā)展。
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