Thermo Scientific™ CloneJET™ PCR Cloning Kit是一個的陽性選擇克隆系統，可以高效克隆各種PCR產物和任何具有平末端或粘性末端的DNA片段。該試劑盒對磷酸化或非磷酸化的DNA片段都有效。陽性選擇載體和插入片段連接僅需5分鐘即可獲得超過99%的陽性重組克隆。PCR產物無需純化。由具有校正活性的聚合酶(如：Pfu polymerase)擴增的平末端PCR產物可直接連入克隆載體。由無校正活性的聚合酶(如：Taq polymerase)或聚合酶混合物擴增的PCR產物在連接前需用試劑盒提供的熱穩定DNA平端化酶削平突出末端(5分鐘即可)。連接產物可直接轉化常用的大腸桿菌菌株。

試劑盒提供一個新穎的即用型陽性選擇克隆載體pJET2.1/blunt。該載體含有致死的限制酶基因(內含多克隆位點)。多克隆位點插入外源片段會引起酶基因失活。因此只有轉化了重組質粒的細菌才能存活形成克隆菌落。而自身環化的pJET1.2/blunt載體表達致死的限制酶(無外源片段插入)，轉化后殺死大腸桿菌細胞。這種陽性篩選策略極大地加速了克隆篩選進程，節省了藍白斑篩選的額外費用。

為方便酶切作圖和插入片段基因操作，pJET1.2/blunt克隆載體的多克隆位點兩側各包含一個BglII識別序列。此外，該載體含有T7啟動子，可用于體內或體外轉錄、插入片段測序等研究。

特點

• 快速 一 PCR克隆只需5分鐘。
• 高效 一 >99%陽性克隆。
• 無克隆背景 一 陽性篩選載體。
• 通用一適合平末端和粘性末端克隆。
• 經濟 一 無需昂貴的藍白篩選。

應用

• 適用平末端和帶有3'-dA尾的PCR產物克隆。
• 限制酶切割產物克隆。
• 測序克隆的DNA。
• 克隆插入片段體內和體外轉錄(T7啟動子介導轉錄)。

質量控制

功能測試：含有3’-dA尾的對照PCR產物克隆證明重組子比率>99%。載體自連實驗表明無克隆背景。pJET1.2 primers適合特異性高效測序。

組分

• pJET1.2/blunt Cloning Vector (pJET1.2 DNA sequence in txt format)
• T4 DNA Ligase
• 2X Reaction Buffer
• Blunting Enzyme
• pJET1.2 Forward Sequencing Primer
• pJET1.2 Reverse Sequencing Primer
• Control PCR Product (sequence of control PCR product in txt format)
• Water, nuclease-free
• 詳細的操作手冊

備注

電轉化前，需用氯仿抽提使連接產物中的T4 DNA連接酶失活。